日本血吸蟲低感染度宿主血清核酸檢測及來源和代謝規(guī)律的研究.pdf

1、目前，血吸蟲病仍是一種嚴(yán)重危害人類健康的主要寄生蟲病，影響范圍涉及亞非拉數(shù)十個(gè)國家和地區(qū)。近年來，隨著我國長期大范圍地實(shí)施以化療為主的血吸蟲病防治策略，主要血吸蟲病流行區(qū)的感染率與感染度已顯著降低，但感染者仍近百萬，流行區(qū)域并沒有明顯縮小。在當(dāng)前血吸蟲病感染率和感染度均呈低度化的新形勢下，現(xiàn)有的診斷方法均不夠理想，特別是對(duì)于反復(fù)感染和治療后的病例，蟲卵糞檢法和循環(huán)抗原檢測法的敏感度太低；而抗體檢測又缺乏特異性，不能區(qū)分現(xiàn)癥病人和既往感染

2、者。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，血吸蟲病的核酸檢測已成為當(dāng)前血吸蟲病診斷研究的熱點(diǎn)之一。本課題組前期工作表明普通PCR法和LAMP法在日本血吸蟲中、高感染度家兔模型的實(shí)驗(yàn)研究中具有早期診斷價(jià)值和療效考核價(jià)值。本研究在普通PCR法的基礎(chǔ)上，建立了一種新的巢式PCR法，進(jìn)一步探索核酸檢測法對(duì)日本血吸蟲低感染度家兔血清DNA的檢測敏感性，并對(duì)感染宿主血清中日本血吸蟲核酸的來源及代謝規(guī)律作了深入探討，初步評(píng)價(jià)了核酸檢測用于日本血吸蟲病病人血清的檢

3、測效果。全文共分三個(gè)部分：
　　 一、巢式PCR法的建立及對(duì)日本血吸蟲低感染度宿主血清DNA的檢測
　　 在普通PCR法的基礎(chǔ)上建立了一種敏感性和特異性更高的巢式PCR法，采用巢式PCR的外引物擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建的重組質(zhì)粒作敏感性檢測，巢式PCR法檢測的敏感性為10.2個(gè)拷貝，比普通PCR法高10倍。且巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶為單一、明亮的特異性條帶，較普通PCR法可更準(zhǔn)確的判斷檢測結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)建立了更符合現(xiàn)場病人實(shí)際狀況

4、的日本血吸蟲低感染度家兔模型（EPG<50；蟲數(shù)<5對(duì)），采用巢式PCR法從感染后3d～19w的外周血清中均能擴(kuò)增到日本血吸蟲特異性DNA片段，尤其是感染30條血吸蟲尾蚴的家兔，體內(nèi)僅存活3對(duì)成蟲（EPG=14）的外周血清也可檢測出特異性DNA片段。實(shí)驗(yàn)證明，巢式PCR法可用于日本血吸蟲低感染度宿主血清DNA的檢測，具有潛在應(yīng)用前景。
　　 二、巢式PCR法檢測日本血吸蟲感染家兔血清DNA用于療效考核的評(píng)價(jià)
　　 應(yīng)用巢

5、式PCR法對(duì)日本血吸蟲中感染度（EPG=232）家兔經(jīng)吡喹酮治療后的宿主血清DNA的檢測結(jié)果表明，治療后第17w（感染后24w）宿主血清中的血吸蟲DNA轉(zhuǎn)為陰性，比前期普通PCR法檢測的結(jié)果晚6w，提示其具有更高的敏感性；而抗體檢測于感染后30w仍維持較高的滴度，表明核酸檢測法具有潛在的療效考核價(jià)值。
　　 三、巢式PCR法對(duì)100例日本血吸蟲病慢性期病人血清DNA的檢測
　　 100例糞檢陽性的慢性期病人血清，采用巢式

6、PCR法檢測的陽性檢出率為78％，其中高感染度的陽性檢出率為100％（4/4），中感染度的陽性檢出率為90％（9/10），低感染度的陽性檢出率為75.6％（65/86），陽性檢出率與感染度相關(guān)。
　　 四、日本血吸蟲感染宿主血清核酸來源及代謝規(guī)律的研究
　　 本實(shí)驗(yàn)建立了單、雙性尾蚴感染的家兔模型。采用巢式PCR法從單性尾蚴感染家兔感染后3d～3w的血清中均可擴(kuò)增到日本血吸蟲特異性DNA片段，感染后4w轉(zhuǎn)為陰性。由此推斷

7、日本血吸蟲感染后3d～3w，血清中的日本血吸蟲核酸主要來源于移行過程中死亡的童蟲殘?bào)w或蟲體發(fā)育過程中更新脫落的含有細(xì)胞核的表皮組織。而雙性尾蚴感染的家兔感染后3d～7w均可擴(kuò)增到陽性條帶，根據(jù)日本血吸蟲的生活史，血吸蟲雌蟲感染宿主4w后發(fā)育成熟并開始大量產(chǎn)卵，因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，宿主感染血吸蟲4w后血清中的血吸蟲核酸主要來源于死亡崩解的蟲卵。為進(jìn)一步研究血吸蟲核酸在宿主外周血中的代謝規(guī)律，實(shí)驗(yàn)組對(duì)上述單性尾蚴感染的家兔連續(xù)3w檢測為陰

8、性結(jié)果后（即感染后第7w）給與吡喹酮治療，同時(shí)對(duì)雙性感染家兔也進(jìn)行治療。采用巢式PCR法繼續(xù)檢測的結(jié)果表明，單性感染的家兔給藥后2d即可在宿主血清中檢測到日本血吸蟲特異性DNA片段，該陽性結(jié)果持續(xù)3w后復(fù)轉(zhuǎn)陰；而雙性感染家兔給藥后16w均可檢測到陽性條帶。上述結(jié)果顯示了宿主血清中血吸蟲核酸代謝的動(dòng)態(tài)變化，即源自死亡成蟲殘?bào)w的核酸代謝物于治療后第2d即可出現(xiàn)在宿主外周血清中，分解代謝3w后逐漸消失；而源自血吸蟲蟲卵的核酸代謝產(chǎn)物，由于蟲卵