腎移植術(shù)后BK病毒感染流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及病毒特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的研究.pdf

1、目的與意義:
　　BK病毒(BK virus,BKV)屬于多瘤病毒(polyomavirus)一種,是導(dǎo)致腎移植術(shù)后移植物腎病的重要危險(xiǎn)因素。隨著腎移植手術(shù)的廣泛開展,由BKV感染導(dǎo)致移植物功能受損、進(jìn)展為BK病毒性腎病(BKVN)進(jìn)而導(dǎo)致移植物丟失的病例報(bào)道逐漸增多。根據(jù)國外研究顯示,在腎移植受者中有1％~5%的人會(huì)發(fā)生BKVN,其中大約50%導(dǎo)致移植腎失功,由此引起了移植學(xué)者的高度重視。當(dāng)前對(duì)引起B(yǎng)KV感染或病毒激活的危險(xiǎn)因素

2、尚不明確,而BKVN與強(qiáng)效免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用的時(shí)間幾乎同時(shí)出現(xiàn),意味著機(jī)體細(xì)胞免疫功能的改變扮演了重要角色,由此大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為移植受者機(jī)體免疫抑制狀態(tài)是引起B(yǎng)KV感染復(fù)發(fā)的最重要因素。然而,目前國外對(duì)腎移植受者BKV感染免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的研究非常少見,國內(nèi)則未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道針對(duì)該領(lǐng)域的探索。因此,本課題在我研究所前期對(duì)BKV感染流行病學(xué)研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步開展前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究,通過監(jiān)測(cè)觀察移植受者的細(xì)胞和體液免疫狀態(tài),揭示BKV感染的免

3、疫機(jī)制,為BKV感染和發(fā)生BKVN的移植受者監(jiān)控以及治療方案的選擇提供免疫學(xué)理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、研究對(duì)象選擇:選擇在解放軍第309醫(yī)院器官移植研究所進(jìn)行同種異體腎移植術(shù)的受者作為研究對(duì)象,并選擇同時(shí)期健康人群做為陰性對(duì)照組。
　　2、標(biāo)本的采集:入組的研究對(duì)象于術(shù)前及術(shù)后每三個(gè)月定期收集尿液和血液標(biāo)本,進(jìn)行real-time PCR BKV DNA載量監(jiān)測(cè),對(duì)于符合標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)象活檢穿刺,行病理學(xué)檢查。

4、r>　　3、研究對(duì)象分組:根據(jù)BKV感染篩查結(jié)果將研究對(duì)象分為四組,即正常受者、病毒尿癥受者、病毒血癥受者和病毒性腎病受者。
　　4、BKV感染監(jiān)測(cè)方法:檢測(cè)研究對(duì)象尿液和血液BKV DNA載體量:收集研究對(duì)象尿液及外周血標(biāo)本,應(yīng)用BKV試劑盒(我所專利技術(shù),專利號(hào):201110211891.1)通過real-time PCR技術(shù)檢測(cè)移植術(shù)后受者尿液及外周學(xué)標(biāo)本BKV DNA載量。檢測(cè)陽性標(biāo)準(zhǔn)為大于或等于1×103copies/m

5、l。
　　5、BKV特異性免疫反應(yīng)的檢測(cè)方法:細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)方法:提取并純化研究對(duì)象外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),流式細(xì)胞儀檢測(cè)研究對(duì)象CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群。制備包含BK病毒 VP1、VP2、VP3、LT-Ag和st-Ag肽段的重疊肽池(overlapping peptide pools),應(yīng)用重疊肽池與PBMC混合培養(yǎng),體外刺激PBMC生成相應(yīng)的細(xì)胞因子,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外培養(yǎng)后PBMC中CD3+、CD4

6、+和CD8+T細(xì)胞亞群,應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)INF-γ/IL-2/TNF-α誘導(dǎo)型BK病毒特異性T細(xì)胞增殖情況,分析BKV細(xì)胞免疫反應(yīng)狀態(tài)。
　　6、其他相關(guān)臨床資料的收集:一般臨床資料(包括研究對(duì)象性別﹑年齡﹑供腎類型﹑配型情況、術(shù)后并發(fā)糖尿病(PTDM)﹑急性排斥反應(yīng)和(AR)術(shù)后早期肺部感染(pneumonia)以及免疫誘導(dǎo)方案、單獨(dú)和聯(lián)合免疫抑制方案等相關(guān)資料);實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(重點(diǎn)記錄移植腎功能指標(biāo)(血肌酐、尿素氮、尿酸)、免

7、疫抑制藥物濃度、血常規(guī)、尿常規(guī)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)指標(biāo))7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用Excel2007軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入及表格繪制。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(16.0版)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應(yīng)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并應(yīng)用隨機(jī)分組t檢驗(yàn)、方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應(yīng)用平均值,最小值和最大值表示,并應(yīng)用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用ROC曲線下面積對(duì)比分析BK病毒尿癥和BK病毒血癥預(yù)測(cè)BKVAN進(jìn)展的價(jià)值,應(yīng)用相關(guān)分析和logi

8、stic回歸分析BK病毒感染的危險(xiǎn)因素。應(yīng)用graphpad(5.0版)軟件進(jìn)行繪圖制作。
　　結(jié)果:
　　1、尿液BKV DNA載量預(yù)測(cè)BKVN發(fā)生的陽性指標(biāo)為5.04±0.15 log10copies/ml,血漿BKV DNA載量為4.08±0.10 log10copies/ml。尿BKV DNA載量指標(biāo)預(yù)測(cè)BKVN發(fā)生的敏感度100%,特異度57.7%(P=0.003),其陽性預(yù)測(cè)值(PV+)為26.3%,陰性預(yù)測(cè)值(

9、PV-)為95.7%。應(yīng)用血BKV DNA載量指標(biāo)預(yù)測(cè)BKVN發(fā)生的敏感度100%,特異度82.9%(P=0.002),其陽性預(yù)測(cè)值(PV+)為83.3%,陰性預(yù)測(cè)值(PV-)為98.8%。
　　2、在對(duì)210例腎移植術(shù)后早期受者的臨床觀察中,尿BKV DNA陽性者92例(43.8%),尿BKV DNA載量中位數(shù)為4.32×105copies/ml(5.73×103~9.44×109 copies/ml);血BKV DNA陽性者4

10、6例(21.9%),血BKV DNA載量中位數(shù)為5.55×103 copies/ml(3.28×103~11.38×106 copies/ml],病理學(xué)活檢證實(shí)BKVN者7例(3.3%)。術(shù)后6~9個(gè)月是病毒尿癥和病毒血癥發(fā)生率最高的時(shí)間點(diǎn)。
　　3、服用FK506是術(shù)后發(fā)生病毒血癥的危險(xiǎn)因素(r=0.232,P=0.012),服用CsA對(duì)發(fā)生病毒血癥的影響顯示了負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.232,P=0.012)。其余各種免疫誘導(dǎo)治療

11、方案(ATG/IL-2R/無誘導(dǎo))與術(shù)后BKV感染的發(fā)生未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P>0.05)。術(shù)前病毒血癥陽性與移植術(shù)后BKV感染有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P<0.05)。性別﹑供腎類型﹑術(shù)后糖尿病、急性排斥反應(yīng)、術(shù)后早期肺部感染均與BKV感染無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P>0.05)。
　　4、腎移植術(shù)后病毒血癥受者的術(shù)后3個(gè)月內(nèi)最低肌酐值為108.6±31.5μmol/L,發(fā)現(xiàn)BK病毒血癥時(shí)的血清肌酐值為187.5±85.6μmol/L,兩者比較有統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.001)。而病毒尿癥受者在發(fā)生前后血肌酐比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　5、腎移植術(shù)后受者BKV特異性蛋白VP1、VP2、VP3、LT和st體外刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)以CD4+ T細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)比例(>90%)。在發(fā)生病毒血癥和BKVN時(shí)VP1、VP2、VP3體外刺激IL-2/IFN-γ+/TNF-α+ CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)度均明顯下降(P<0.05)。LT、st體外刺激細(xì)胞性免疫反應(yīng)變化差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差

13、異(P>0.05)。
　　6、腎移植術(shù)后病毒尿癥和病毒血癥受者在體外刺激IL-2/IFN-γ+/TNF-α+ CD4+ T細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)度中VP1、VP2、VP3蛋白的反應(yīng)強(qiáng)度普遍高于LT和st蛋白,而VP1和 VP3蛋白又顯著高于 VP2蛋白(P<0.05),兩兩比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著差異(P<0.05)。
　　7、腎移植術(shù)后持續(xù)BKV病毒血癥受者易發(fā)展為BKVN,此類受者的5種BKV特異性蛋白體外刺激IL-2/IFN-

14、γ+/TNF-α+ CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度呈明顯下降趨勢(shì)。在持續(xù)病毒尿癥受者中未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。
　　結(jié)論:
　　1、應(yīng)用我研究所自行研發(fā)的BKV DNA載量檢測(cè)試劑盒預(yù)測(cè)BKVN的指標(biāo)為:尿液BKV DNA載量陽性值為107copies/ml,血漿BKV DNA載量陽性值為105copies/ml。即當(dāng)檢測(cè)標(biāo)本BKV DNA載量大于陽性值時(shí)可作為明確BKVN的診斷指標(biāo)。
　　2、腎移植術(shù)后早期應(yīng)規(guī)律定期監(jiān)測(cè)尿、血標(biāo)本

15、中BKV DNA載量變化,尤其在術(shù)后6~9個(gè)月是BKV感染的高峰時(shí)段,監(jiān)測(cè)BKV感染的間隔時(shí)間最長不應(yīng)超過3個(gè)月,對(duì)持續(xù)BK病毒尿癥受者必須進(jìn)一步明確病毒血癥的發(fā)生。
　　3、FK506是腎移植術(shù)后BKV感染進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,對(duì)于術(shù)后高危受者可采取減免該種類藥物或更換為其他免疫抑制藥物的措施。對(duì)移植術(shù)前對(duì)供、受者進(jìn)行常規(guī)的BKV篩查是預(yù)防和減少術(shù)后進(jìn)展為BK病毒血癥和BKVAN的另一有效措施。對(duì)術(shù)前BKV陽性受者,術(shù)后應(yīng)加大對(duì)B

16、KV感染的監(jiān)測(cè)力度,同時(shí)早期給予適當(dāng)?shù)念A(yù)防性臨床干預(yù)措施。
　　4、BKV感染發(fā)展至病毒血癥階段即可能影響移植腎功能,對(duì)發(fā)現(xiàn)BK病毒血癥的受者,尤其是持續(xù)病毒血癥的受者應(yīng)及時(shí)進(jìn)行降低免疫抑制藥物等臨床干預(yù),減緩進(jìn)展為BKVN的幾率。
　　5、體外刺激腎移植術(shù)后受者BKV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)以CD4+ T細(xì)胞免疫反應(yīng)為主。移植受者 BKV感染發(fā)展至病毒血癥階段時(shí),VP1、VP2、VP3三種結(jié)構(gòu)蛋白體外刺激病毒特異性免疫反應(yīng)的強(qiáng)度