在氨基酸反應中探討左旋門冬酰胺酶殺傷MOLT-4細胞的機制.pdf

1、目的：
　　 左旋門冬酰胺酶(L-asparaginase，L-asp)是治療兒童急性淋巴細胞白血病(Acute lymphocytic leukemia，ALL)的重要化療藥物之一。單獨使用L-asp可以使兒童ALL的完全緩解率達到40％-60％。其作用機制如下：它可以水解血液/培養(yǎng)液中的門冬酰胺，導致細胞內的門冬酰胺水平降低，令細胞蛋白質合成受阻，細胞趨于凋亡。盡管L-asp是一種歷時彌久的老藥，但其殺傷細胞的具體分子機制仍

2、不清楚。
　　 本實驗通過對T淋巴細胞白血病細胞系MOLT-4進行體外實驗，研究L-asp對MOLT-4細胞的增殖抑制作用，并觀察ASNS、CHOP、Bax及Bcl2mRNA在L-asp作用后不同時間點的表達情況，從中探討可能存在的凋亡機制。這在國內外文獻未見報道，本研究將為L-asp的作用機制提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、細胞培養(yǎng)及胎盼蘭拒染法檢測細胞存活率
　　 將MOLT-4細胞進行復

3、蘇培養(yǎng)，急性T淋巴細胞白血病MOLT-4細胞株，置于含10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每2d至3d傳代1次。取對數(shù)生長期細胞，接種至6孔培養(yǎng)板，細胞濃度為5×105/ml。培養(yǎng)24h后實驗分組如下：1.對照組(細胞培養(yǎng)液中不加任何藥物)；2.實驗組：用1IU/mlL-asp處理。實驗組和對照組分別于加藥處理后的12h，18h，24h，4

4、8h，96h計數(shù)活細胞數(shù)。計數(shù)時先制備細胞懸液，用0.2％臺盼藍染色以判定細胞活性(活細胞不著色)，取少量細胞懸液滴于細胞計數(shù)板上，顯微鏡下計數(shù)。
　　 二、實時定量熒光PCR
　　 分別收集用1IU/ml的L-asp處理后的MOLT-4細胞，提取總RNA，按試劑盒說明書配置逆轉錄反應體系合成cDNA；引物由Takara公司設計合成，采用SYBRGreenⅠ實時定量熒光PCR方法，以GAPDH為內參照，進行SYRBGre

5、enⅠ實時熒光定量PCR，檢測ASNS、CHOP、Bax及Bcl2mRNA表達水平。
　　 三、結果判斷
　　 將標準品cDNA10倍濃度梯度稀釋為5-6個濃度梯度，各取2μL作為模板進行RealTime PCR反應，由各擴增曲線得到的CT值制作標準曲線，從而得到樣本的拷貝數(shù)。以GAPDH作為內參照，CHOP，ASNS，Bcl2及Bax作為目的基因，通過目的基因和內參基因拷貝數(shù)的比值進行樣本間相對定量的比較。
　　

6、 四、統(tǒng)計學分析
　　 采用SAS(SAS for Windows，9.2版本)軟件進行統(tǒng)計分析。實驗結果用(x-±s)表示，應用Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗考察目的基因的相對mRNA表達水平在不同的時間點的差異表達情況。
　　 結果：
　　 一、方法的可靠性和準確性
　　 1、RNA的純度和質量分析
　　 所提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，比值在1.8-2.0之間，經(jīng)瓊脂

7、糖凝膠電泳鑒定，條帶清晰可見，無明顯降解。
　　 2、擴增的特異性及定量的準確性
　　 標準品cDNA經(jīng)梯度稀釋后進行PCR反應，制作標準曲線。得到的標準曲線相關系數(shù)(r2)均>0.998，斜率在-3.3至-3.5之間，反映定量準確，擴增效率良好。擴增后溶解曲線顯示銳利的單一鋒，無其他非特異性鋒，說明擴增產(chǎn)物均一，無非特異擴增及引物二聚體。瓊脂糖凝膠電泳進一步驗證擴增片段的均一性及長度。
　　 二、1IU/mlL

8、-asp對MOLT-4細胞增殖的影響
　　 1Iu/mlL-asp作用于MOLT-4細胞的0-96h內，在不同時間點測得的細胞存活率與細胞存活數(shù)。18h之前實驗組與對照組的細胞存活率無顯著差異(P>0.05)，實驗組細胞存活數(shù)自24h后開始顯著下降(與18h及48h相比較，P<0.05)，72h時細胞幾乎全部死亡；實驗組與對照組的細胞存活率在0-12h內差異不顯著(P>0.05)，自18h開始實驗組細胞存活率顯著下降(L-asp

9、作用后的18h與12h及24h相比較，P<0.05)。
　　 三、L-asp對MOLT-4細胞CHOP，ASNS，Bcl2及BaxmRNA表達的影響
　　 在L-asp用藥后的8h和18hCHOP與ASNSmRNA出現(xiàn)兩次表達高峰，18h后CHOPmRNA水平仍維持在較高水平，ASNSmRNA開始逐漸下降；Bax/Bcl2比值也于18h后顯著升高。
　　 結論：
　　 左旋門冬酰胺酶殺傷MOLT-4細胞可