大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對梗死后心肌中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的調(diào)控及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對梗死后心肌中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的調(diào)控，并探討其可能機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定SD大鼠MSCs，并選擇最佳分離培養(yǎng)MSCs的方法：(1)采用現(xiàn)行兩種主要分離培養(yǎng)MSCs的方法：密度梯度離心法、全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)MSCs，并對全骨髓貼壁法加以改進(jìn)，選擇MSCs培養(yǎng)生長增殖狀態(tài)最佳的培養(yǎng)方法來培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用MSCs；(2)使用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測MSC

2、s表面兩種抗原分子的表達(dá)情況：CD29、CD45；(3)加入成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)體系，觀察MSCs向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化的能力，以鑒定其多向分化潛能；(4)采用Brdu標(biāo)記法標(biāo)記移植用細(xì)胞，并檢測其細(xì)胞活力。
　　 2.大鼠心梗模型的制作及心律失常至造模失敗分析、心肌勻漿的制作：(1)采用開胸直視下結(jié)扎左前降支的方法制作大鼠急性心肌梗死模型；(2)分析早期心律失常至造模失敗機(jī)制，并加以預(yù)防改進(jìn)；(3)心梗后心肌勻漿制作：

3、使用組織勻漿機(jī)研磨心肌組織塊，取勻漿上清并過濾除菌。
　　 3.體外模擬心梗后微環(huán)境，單培養(yǎng)及和培養(yǎng)MSCs與心肌成纖維細(xì)胞，觀察兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況：(1)使用心梗后心肌勻漿加入培養(yǎng)基，模擬心梗后微環(huán)境；(2)單培養(yǎng)或和培養(yǎng)兩種細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)染色的方法觀察兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況；(3)應(yīng)用ELASA法檢測培養(yǎng)基質(zhì)中TGF-β1、TNF-α、PDGF的濃度變化。
　　 4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：大鼠心梗模型建模14天后，對大鼠心臟

4、心梗周邊區(qū)多點(diǎn)分別注射含TGF-β1150μLDMEM培養(yǎng)液(n＝13)，PBS150μL(n＝13)，5×106MSCs/150μL(n＝13)。移植后一月，處死大鼠，獲取心臟標(biāo)本，采用組織病理、免疫組化的方法鑒定移植部位有無肌纖維母細(xì)胞的聚集，并采用westen-blot、PCR分析膠原蛋白的產(chǎn)生情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.全骨髓貼壁法組MSCs傳代、生長速度明顯快于密度梯度離心法法組MSCs，兩組細(xì)胞流式細(xì)胞儀

5、鑒定、分化能力鑒定及細(xì)胞活力均符合實(shí)驗(yàn)要求；
　　 2.青年組大鼠心律失常、室顫及早期死亡率均明顯低于中年組大鼠，心律失常發(fā)生率與兩組大鼠血清NE值增加速度成正比：
　　 3.利多卡因術(shù)前腹腔注射后，早期心律失常發(fā)生率下降，早期造模成功率升高；
　　 4.差速貼壁法可以分離培養(yǎng)的第二代成纖維細(xì)胞，MSCs與心臟成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，加用心梗14天后心梗周邊區(qū)域心肌勻漿干預(yù)7-28天后行平滑肌肌動蛋白(α-SMA)免疫

6、細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性，ELASA法檢測到急性心梗后14天心梗周邊去心肌勻漿干預(yù)MSCs單培養(yǎng)組、MSCs與心臟成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組細(xì)胞因子TGF-β1濃度明顯高于其他組，且與肌纖維母細(xì)胞陽性率正相關(guān)；
　　 5、MSCs移植組的梗死心肌內(nèi)存在大量BrdU標(biāo)記陽性的移植細(xì)胞，Brdu陽性區(qū)連續(xù)切片行波形蛋白及平滑肌肌動蛋白免疫組化染色陽性，Brdu陰性區(qū)連續(xù)切片行平滑肌肌動蛋白免疫組化染色陰性；移植后MSCs移植區(qū)、TGF-β1注射區(qū)

7、、PBS注射區(qū)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ mRNA及蛋白的表達(dá)，PBS注射區(qū)明顯小于MSCs移植區(qū)、TGF-β1注射區(qū)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.全骨髓貼壁法組MSCs生長增殖速度明顯快于密度梯度離心法法組MSCs，并符合實(shí)驗(yàn)使用要求；
　　 2.開胸直視結(jié)扎左前降支能有效制作大鼠急性心肌梗死模型，其早期心律失常至造模失敗率與血清NE值升高速度正相關(guān)，術(shù)前腹腔注射利多卡因能提高造模成功率；

8、
　　 3.差速貼壁法可分離培養(yǎng)出心臟成纖維母細(xì)胞，急性心梗后14天心梗周邊去心肌勻漿干預(yù)MSCs與心臟成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組細(xì)胞7-28天后可形成肌纖維母細(xì)胞，并由成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，急性心梗后14天心梗周邊去心肌勻漿干預(yù)MSCs（無論單培養(yǎng)還是與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)）可分泌一定量的細(xì)胞因子TGF-β1，TGF-β1參與成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)型；
　　 4.大鼠心臟對移植MSCs無明顯免疫排斥，移植MSCs14天后，MS