Oct-4在精原干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化中的表達(dá)及其甲基化的研究.pdf

1、目的：體外分離培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞(mouse spermatogonial stem cells,mSSCs)，并通過干細(xì)胞因子（SCF，stem cell factor）誘導(dǎo)其向精母細(xì)胞方向分化，觀察小鼠精原干細(xì)胞在誘導(dǎo)分化前后Oct-4的表達(dá)情況，并檢測其甲基化狀態(tài)，為進(jìn)一步研究Oct-4在mSSCs分化中的作用以及探討表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)對(duì)干細(xì)胞分化的影響提供研究思路。
　　 方法：采用與支持細(xì)胞共培養(yǎng)法，分離培養(yǎng)6～8天BA

2、BL/C小鼠的SSCs，培養(yǎng)48h時(shí)用含10％ FBS和50ng/mL SCF的L-DMEM培養(yǎng)基對(duì)mSSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，觀察mSSCs加入誘導(dǎo)劑前后的形態(tài)學(xué)變化，用c-kit、GCNF的表達(dá)鑒定mSSCs是否發(fā)生分化。分別采用RT-PCR和間接免疫熒光染色技術(shù)，從mRNA和蛋白水平檢測Oct-4在mSSCs誘導(dǎo)分化前和分化后2 d、5d的表達(dá)情況，運(yùn)用甲基化特異性PCR檢測Oct-4在mSSCs誘導(dǎo)分化前和分化后2 d、5d的甲基化

3、狀態(tài)。
　　 結(jié)果：1、形態(tài)學(xué)觀察mSSCs細(xì)胞核較大，細(xì)胞質(zhì)少，SCF誘導(dǎo)培養(yǎng)后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞克隆逐漸增長緩慢，并出現(xiàn)衰退、凋亡的細(xì)胞；2、間接免疫熒光染色顯示，mSSCs表達(dá)c-kit，不表達(dá)GCNF，但誘導(dǎo)5d后不表達(dá)c-kit，表達(dá)GCNF；3、間接免疫熒光染色和RT-PCR顯示，Oct-4在mSSCs誘導(dǎo)前表達(dá)水平最高，誘導(dǎo)2 d后下降，5d后幾乎不表達(dá)；4、甲基化特異性PCR顯示，Oct-4在mSSCs誘