鞘氨醇激酶在人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及其與TGF-β1的關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的： 瘢痕疙瘩是臨床上常見的病理性瘢痕，以成纖維細(xì)胞的異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)成分的過度堆積為主要特征。其生長行為有類似腫瘤的特性，表現(xiàn)為向周圍正常皮膚侵襲性生長、單純手術(shù)切除術(shù)后易復(fù)發(fā)等，發(fā)病機(jī)制至今不明，在治療上尚無特效方法，是目前整形外科研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題之一。 在哺乳動物中，鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）有多種亞型，其中已有2種亞型被克隆出來，即SphK1和SphK2。SphK

2、1具有促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡的作用，SphK2主要作用是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)化生長因子β（ransforming growth factorβ，TGF—β）是導(dǎo)致病理性瘢痕產(chǎn)生的重要因素之一，而且在人皮膚和肺的成纖維細(xì)胞中TGF—β1上調(diào)SphK1的表達(dá)。目前，國內(nèi)外有關(guān)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞SphK1和SphK2的表達(dá)及其與TGF—β1的關(guān)系未見報道。 本研究通過檢測SphK1和SphK2在人正常皮膚成纖維細(xì)胞和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞

3、中的表達(dá)差異，推斷兩者在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖過程中的作用；通過檢測加入TGF—β1前后SphK1和SphK2在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)差異，探討SphK1和SphK2與TGF—β的關(guān)系，以期能進(jìn)一步闡明瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制。 方法： 1、收集12例瘢痕疙瘩患者手術(shù)切除的瘢痕疙瘩及其周圍正常皮膚標(biāo)本，組織塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，取第3～8代成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩加轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF—β

4、1）組（瘢痕疙瘩+TGF—β1組）。 2、各組成纖維細(xì)胞分別培養(yǎng)爬片后，用免疫熒光法觀察各組細(xì)胞中SphK1和SphK2蛋白的分布； 3、Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，Real—Time PCR法定量檢測SphK1和SphK2 mRNA的表達(dá)； 4、用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白質(zhì)印跡法檢測SphK1和SphK2蛋白的表達(dá)。

5、 結(jié)果： 1、在各組成纖維細(xì)胞中，SphK1蛋白均主要分布于細(xì)胞核，而SphK2蛋白在細(xì)胞核和胞質(zhì)中均有表達(dá)。 2、正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1mRNA表達(dá)分別是0．0383±0．0147、0．0608±0．0190和0．0790±0．0280，可見瘢痕疙瘩組SphK1mRNA表達(dá)明顯高于正常皮膚組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）；瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1mRNA表達(dá)明

6、顯高于瘢痕疙瘩組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK2 mRNA表達(dá)分別是0．0036±0．0011、0．0032±0．0014和0．0033±0．0021，3組之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。各組SphK1mRNA的表達(dá)較SphK2mRNA表達(dá)高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）；正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1/SphK2mRNA比值分

7、別是10．5784±1．9007，20．2037±3．2254，22．7297±3．3306，可見瘢痕疙瘩組SphK1/SphK2比值明顯高于正常皮膚組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）；瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1/SphK2mRNA比值明顯高于瘢痕疙瘩組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。 3、正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1蛋白表達(dá)分別是0．6800±0．11260、0．8308±0．1

8、0930和1．4267±0．19380，可見瘢痕疙瘩組SphK1蛋白表達(dá)明顯高于正常皮膚組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）；瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1蛋白表達(dá)明顯高于瘢痕疙瘩組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）。正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK2 mRNA表達(dá)分別是0．0763±0．0091、0．0724±0．0069和0．0773±0．0083，3組之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。各組

9、SphK1蛋白表達(dá)較SphK2蛋白表達(dá)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）；正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1/SphK2蛋白比值分別是8．8747±0．6927，11．4413±0．5012，18．4230±0．7713，可見瘢痕疙瘩組SphK1/SphK2蛋白比值明顯高于正常皮膚組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）；瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1/SphK2比值明顯高于瘢痕疙瘩組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

10、<0．01）。 結(jié)論： 1、在正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，SphK1和SphK2均有表達(dá)，但二者的分布有差異，SphK1主要在細(xì)胞核中表達(dá)，而SphK2在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá)。 2、SphK1在正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)有差異，在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中SphK1mRNA水平和蛋白水平較正常皮膚成纖維細(xì)胞高，說明SphK1的高表達(dá)與瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，SphK1可能是促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞

11、過度生長的一個重要因子；SphK2在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明SphK2雖有促凋亡的作用，但不能有效的促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡，不能有效地對抗SphK1導(dǎo)致促瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長的作用。SphK1和SphK2作用的失衡，可能是導(dǎo)致瘢痕疙瘩增生的重要機(jī)制之一。 3、SphK1 mRNA和蛋白在正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)均比SphK2高，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Sp

12、hK1/SphK2mRNA和蛋白比值較正常皮膚成纖維細(xì)胞為高，存在SphK1的高表達(dá)，反映了瘢痕疙瘩和正常皮膚中SphK1、SphK2的含量并不是相等的，在維持成纖維細(xì)胞的生長增殖過程中的作用是有差異的；SphK1/SphK2比值增高，可能與瘢痕疙瘩的過度生長有關(guān)，可以預(yù)測SphK1/SphK2比值是判斷瘢痕疙瘩增生程度的指標(biāo)。 4、在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中加入TGF—β1刺激后，SphK1 mRNA水平和蛋白水平均表達(dá)增高，Sp