功能性電刺激對(duì)腦梗死大鼠腦bFGF、EGF表達(dá)和神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的研究.pdf

1、背景：
　　 腦卒中(stroke)，又稱中風(fēng)、腦血管意外，是指急性起病、迅速出現(xiàn)局限性或彌漫性腦功能缺失征象的腦血管性臨床事件。腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病及多發(fā)病，目前已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)成人致死和致殘的第二大病因。其中，88％腦卒中為缺血性腦腦卒中——腦梗死，腦梗死是目前腦卒中研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。
　　 腦卒中后偏癱即肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙，是主要的殘疾病征。急性期患者的發(fā)生率約為80％，嚴(yán)重影響了患者的日常生活活動(dòng)能力，給患

2、者、家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)。隨著生活水平的提高和醫(yī)療模式的轉(zhuǎn)變，對(duì)腦卒中的治療不只是挽救和延長(zhǎng)患者的生命，更強(qiáng)調(diào)改善患者的生活自理能力和提高生存質(zhì)量，因此，卒中后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)具有重要意義。
　　 腦卒中發(fā)生后患者的運(yùn)動(dòng)功能會(huì)有一定程度的自我恢復(fù)。然而這種程度的恢復(fù)并不能滿足患者及其家屬對(duì)于卒中后日常生活和工作的需求。研究證明，從以Bobath、Brunnstrom和Rood技術(shù)為代表的神經(jīng)促進(jìn)技術(shù)到近年來以運(yùn)動(dòng)再學(xué)習(xí)、重復(fù)性

3、訓(xùn)練、強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)療法和神經(jīng)肌肉電刺激為代表的新興康復(fù)手段都被證明能夠改善患者感覺運(yùn)動(dòng)功能和行為能力，提高患者生活自理能力，改善其生活質(zhì)量。
　　 功能性電刺激(functional electrical stimulation，F(xiàn)ES)就是一種新興的物理治療技術(shù)，屬于神經(jīng)肌肉電刺激的范疇。近年來，國(guó)內(nèi)外大量臨床研究表明，功能性電刺激能顯著改善腦卒中患者的肢體功能，明顯降低致殘率。盡管如此，F(xiàn)ES治療所產(chǎn)生的上述功能性結(jié)局的改變，

4、其具體機(jī)理尚未明了。雖然普遍認(rèn)為可能與神經(jīng)可塑性(neuroplasticity)和功能重組(functional organization)有關(guān)，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究相對(duì)較少，其功能恢復(fù)的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和其神經(jīng)可塑性的具體發(fā)生機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入闡明。
　　 另一方面，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSC)是神經(jīng)可塑性研究方向最重要的熱點(diǎn)。近年來關(guān)于NSC的研究主要集中在兩個(gè)方面：外源性和內(nèi)源性NSC。相對(duì)與外源性NS

5、C具有的來源困難、醫(yī)學(xué)倫理、難以控制數(shù)量、遷移途徑不明和如何功能重組等瓶頸問題，內(nèi)源性NSC顯示出來源穩(wěn)定可靠、無免疫原性、避免內(nèi)環(huán)境紊亂和無成瘤危險(xiǎn)等特有優(yōu)勢(shì)而成為研究的主要方向。
　　 目前公認(rèn)的哺乳動(dòng)物腦內(nèi)源性NSC集中在海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層下區(qū)(subgranularzone，SGZ)和腦室管膜下區(qū)(subventricularzone，SVZ)。研究表明，在卒中等病理狀態(tài)下，內(nèi)源性NSC會(huì)發(fā)生增殖現(xiàn)象，參與神經(jīng)修復(fù)。同

6、時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在眾多的影響內(nèi)源性NSC增殖的因素中，以堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)為代表的細(xì)胞因子是最重要的一種。
　　 然而，這種程度的內(nèi)源性NSC增殖不足以完全替換壞死的神經(jīng)細(xì)胞，難以徹底重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。因此，如何有效的促進(jìn)內(nèi)源性NSC的增殖，通過外來干預(yù)手段增加NSC的數(shù)量、修復(fù)神經(jīng)功能成為

7、目前干細(xì)胞研究的前沿領(lǐng)域。
　　 目的：
　　 建立“線栓法”大鼠腦梗死模型，觀察FES治療對(duì)腦梗死大鼠運(yùn)動(dòng)功能(行為學(xué))恢復(fù)的影響。同時(shí)，觀察大鼠腦梗死側(cè)組織bFGF、EGF、Nestin的表達(dá)量，并對(duì)梗死側(cè)SVZ和SGZ區(qū)內(nèi)源性NSC數(shù)量的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，從而探討FES治療促進(jìn)腦梗死大鼠功能恢復(fù)的可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 清潔級(jí)成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體重(270±3

8、0)g。共造模成功108只大鼠，按電腦隨機(jī)數(shù)字表的方法隨機(jī)分為FES治療組、安慰刺激組和假手術(shù)組(每組各36只)。FES治療組、安慰刺激組大鼠以10％水合氯醛按0.4mg/kg體重劑量行腹腔注射麻醉，以Longa線栓法建立大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型，之后再行FES治療電極安置手術(shù)。于術(shù)后6h采用改良的Bederson標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能初步評(píng)分，選取神經(jīng)功能評(píng)分為2～3分的大鼠納入本研究。假手術(shù)組大鼠行相同切口，但不以栓線

9、阻斷左側(cè)MCA的血流，作為正常對(duì)照。FES治療組、安慰刺激組和假手術(shù)組又分為FES治療基線組、3天組、7天組和14天組(每組各9只)。
　　 FES治療組大鼠于造模術(shù)后3d開始FES治療(每天1次，每次10min)，刺激參數(shù)為雙向?qū)ΨQ方波，頻率30Hz，脈寬250甲，波升/波降為1s/1s，強(qiáng)度3mA，通斷比為3s∶5s；安慰刺激組連接FES治療導(dǎo)線，但不予電刺激；假手術(shù)組不予特殊處理。各組大鼠手術(shù)或假手術(shù)后均分別置于普通籠內(nèi)飼

10、養(yǎng)(3～4只/籠)，籠內(nèi)環(huán)境和飼養(yǎng)條件相同。
　　 于FES治療基線、治療第3d，7d，14d各時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行平衡木試驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)和網(wǎng)屏試驗(yàn)評(píng)定，隨后處死取材，通過免疫組化觀察大鼠梗死側(cè)大腦海馬齒狀回和室管膜下區(qū)NSC巢蛋白(Nestin)表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)目，并采用免疫印跡法(western blotting)和RT-PCR方法檢測(cè)大鼠梗死側(cè)腦組織bFGF、EGF、Nestin的蛋白和基因表達(dá)量。
　　 應(yīng)用SPSS13

11、.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組結(jié)果以x±s表示，組間相同時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素方差分析。設(shè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.在FES治療基線和治療第3d、7d時(shí)，F(xiàn)ES治療組和安慰刺激組網(wǎng)的屏試驗(yàn)評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在FES治療第14d時(shí)，F(xiàn)ES治療組大鼠的網(wǎng)屏試驗(yàn)評(píng)分優(yōu)于安慰刺激組(P＜0.05)。在任何一時(shí)間點(diǎn)，F(xiàn)ES治療組和安慰刺激組在平衡木、轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)評(píng)分的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.0

12、5)。
　　 2.FES組大鼠梗死側(cè)腦組織bFGF、EGF的蛋白表達(dá)量在FES治療第3d時(shí)已經(jīng)開始增加，治療第7d時(shí)進(jìn)一步升高，較安慰刺激組和假手術(shù)組差異有顯著性意義(P＜0.05)，在治療第14d時(shí)mRNA表達(dá)量較第7d時(shí)略有下降，但仍高于安慰刺激組和假手術(shù)組(P＜0.05)。
　　 3.FES組大鼠梗死側(cè)腦組織bFGF、EGF的基因表達(dá)量在FES治療第3d時(shí)已經(jīng)開始增加，治療第7d時(shí)進(jìn)一步升高，較安慰刺激組和假手術(shù)組

13、差異有顯著性意義(P＜0.05)，在治療第14d時(shí)mRNA表達(dá)量較第7d時(shí)略有下降，但仍高于安慰刺激組和假手術(shù)組(P＜0.05)?；虮磉_(dá)量的變化趨勢(shì)與蛋白量變化保持一致。
　　 4.FES治療組和安慰刺激組SGZ和SVZ區(qū)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)在治療第3d時(shí)增高，第7d時(shí)達(dá)到高峰，14d時(shí)有所下降，兩組各時(shí)間點(diǎn)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)均高于假手術(shù)組，差異具有顯著性意義(P＜0.05)。FES治療組第3d Nestin陽性細(xì)胞數(shù)較

14、安慰刺激組增高，差異無顯著性意義(P＞0.05)，但在第7d、14d時(shí)差異具有顯著性意義(P＜0.05)。Nestin陽性細(xì)胞數(shù)的變化趨勢(shì)和bFGF、EGF的變化保持一致。
　　 結(jié)論：
　　 1.FES治療能促進(jìn)腦梗死大鼠行為學(xué)的恢復(fù)。
　　 2.FES治療能上調(diào)大鼠梗死側(cè)腦組織bFGF、EGF、Nestin的表達(dá)量。
　　 3.FES治療能促機(jī)大鼠梗死側(cè)腦組織SGZ和SVZ區(qū)內(nèi)源性NSC的增殖。