殼聚糖膜聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合的實驗研究.pdf

1、難愈性創(chuàng)面（Refractory Wound，RW）是指在期望的時間內(nèi)不能正常愈合，與創(chuàng)面所在部位和宿主本身疾病有關(guān)的一類創(chuàng)面，目前臨床上發(fā)病率非常高。細(xì)胞移植療法(Cell Transplantation Therapy，CTT)不依賴于外科植皮手術(shù)，能夠顯著改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。目前細(xì)胞移植療法相關(guān)的基礎(chǔ)與臨床研究是國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，且治療所應(yīng)用的種子細(xì)胞來源廣泛，具有良好的應(yīng)用前景。近年來隨著材料科學(xué)的發(fā)展，選擇一種與細(xì)胞移植療法相適應(yīng)

2、的生物工程材料可以為難治性創(chuàng)面治療提供不同的治療策略。殼聚糖(Chitosan，CS)作為一種生物相容性極佳的可降解材料，對人體無毒副作用，且具有抗炎、抗氧化、止血、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、鎮(zhèn)痛、抗感染等多種利于機(jī)體修復(fù)的生物學(xué)特性，是一種非常適合應(yīng)用于難愈性創(chuàng)面修復(fù)的生物工程材料。殼聚糖水凝膠(Chitosan Hydrogels，CSH)目前已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥等領(lǐng)域，臨床實驗已取得一定成果，但其相關(guān)機(jī)制研究仍不甚明確，制約了其在皮膚創(chuàng)面愈合

3、方面進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。本文旨在通過實驗合成一種新型殼聚糖水凝膠，聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells，ADSCs）共同應(yīng)用于難愈性創(chuàng)面的治療，研究殼聚糖水凝膠聯(lián)合ADSCs對難愈性創(chuàng)面的療效并探討其部分生物學(xué)機(jī)制，為臨床治療難愈性創(chuàng)面提供一種新的治療策略。
　　目的：
　　通過建立一種高效的ADSCs分離培養(yǎng)體系，觀察ADSCs的生物學(xué)特征并通過適宜培養(yǎng)方法實現(xiàn)A

4、DSCs的大規(guī)模擴(kuò)增，并對新型殼聚糖水凝膠的制備方法進(jìn)行探索性研究，并系統(tǒng)性分析其成膜性、細(xì)胞毒性及表面結(jié)構(gòu)，觀察殼聚糖水凝膠聯(lián)合ADSCs對難愈性創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用，并對其生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行深入探討。
　　方法：
　　選用SPF級綠色熒光蛋白（GreenFlourescent Protein，GPF）轉(zhuǎn)基因小鼠，取腹股溝處脂肪墊，膠原酶消化法獲取ADSCs，流式分析細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物，并誘導(dǎo)細(xì)胞向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)

5、胞方向分化，觀察 ADSCs多向分化能力。制備成功的殼聚糖膜后用掃描電鏡檢測其表面結(jié)構(gòu)，同時制備殼聚糖膜的浸液，進(jìn)行ADSCs細(xì)胞毒性檢測。將制備成功的小鼠全層皮膚缺損模型為四組：A組：生理鹽水組；B組：CSH組；C組：ADSCs組；D組：CSH+ADSCs組。術(shù)后每天觀察創(chuàng)面有無感染、異常分泌物等情況，并隔天記錄創(chuàng)面面積以計算創(chuàng)面愈合率。術(shù)后14d在取創(chuàng)面皮膚組織進(jìn)行冰凍切片，觀察創(chuàng)面皮膚組織中GFP陽性細(xì)胞存活情況，以評估ADSCs

6、參與創(chuàng)面愈合情況， HE切片觀察創(chuàng)面皮膚組織中肉芽組織增生和上皮化過程。同時行Western Blot方法檢測創(chuàng)面組織GFP、VEGP蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.實現(xiàn)了ADSCs的成功分離，其形態(tài)上呈紡錘形，具備典型的間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）的形態(tài)學(xué)特征。流式檢測結(jié)果顯示ADSCs高表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)記物CD10、CD13、CD166以及粘附因子CD29及CD54；低表達(dá)造血系

7、細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34及血管內(nèi)皮性抗原CD45。ADSCs成脂細(xì)胞誘導(dǎo)后，蘇丹Ⅲ染色示細(xì)胞中心發(fā)現(xiàn)橘黃色小泡；ADSCs成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后ALP堿性磷酸酶染色示細(xì)胞有黑色結(jié)節(jié)；ADSCs成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后阿辛藍(lán)染色后細(xì)胞呈紫色。
　　2.制備成功的CSH通體透亮，微呈黃色或無色，呈半流動凝膠狀。制成后的CSD體積萎縮明顯，并具有一定柔韌性和吸水性。5萬倍掃描電鏡結(jié)果顯示殼聚糖膜膜體表面呈顆粒狀，有大小不一裂隙。細(xì)胞毒性實驗表明，殼聚糖膜

8、具有良好的生物相容性。
　　3.皮膚全層損傷模型顯示：與對照組相比，術(shù)后14d和18d時D組創(chuàng)面愈合率較高（P<0.05），在術(shù)后21d時B組、C組和D組的創(chuàng)面愈合率都要高于A組（P<0.05）。HE染色顯示，實驗組B組、C組和D組各組與正常皮膚結(jié)構(gòu)形態(tài)相似，且D組形態(tài)最為接近正常皮膚結(jié)構(gòu)。熒光顯微鏡下，移植了ADSCs的C組和D組創(chuàng)面組織可見位于散落點(diǎn)狀熒光，且D組熒光強(qiáng)度高于C組。光鏡觀察：HE染色發(fā)現(xiàn) B組、C組、D組的創(chuàng)面

9、修復(fù)速度和炎性細(xì)胞浸潤狀況低于對照組A組。創(chuàng)面蛋白表達(dá)：Westemblot結(jié)果表明，D組術(shù)后第14天VEGF蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組A組，而且以D組表達(dá)最高(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.本實驗分離所得細(xì)胞高表達(dá) CD10、CD13、CD29、CD54、CD166，低表達(dá)CD34及CD45，表面標(biāo)記物符合文獻(xiàn)已報道的ADSCs表型。ADSCs可誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞，具有多向分化潛能。
　　

10、2.殼聚糖有很好的吸附性、成膜性、吸濕性和保濕性，且生物來源廣泛、價格低廉、安全無毒，是一種極佳的可應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)的生物工程材料。本研究制成的殼聚糖水凝膠具有安全低毒，易成膜的特性，可作為創(chuàng)面的生物敷料應(yīng)用于臨床。
　　3. ADSCs免疫原性低，移植于小鼠創(chuàng)面后一定時期內(nèi)仍可在組織內(nèi)存活而不被宿主排斥，保證了移植后早期細(xì)胞持續(xù)發(fā)揮作用，殼聚糖可在創(chuàng)面上形成一層保護(hù)膜，起到了保護(hù)創(chuàng)面且防止移植的ADSCs流失的作用。CSH聯(lián)合AD