重組納豆激酶多抗的制備及應(yīng)用在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、納豆激酶(Nattokinase，NK)是由納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)分泌的一種具有強(qiáng)纖溶活性的絲氨酸蛋白酶。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明該酶能顯著溶解體內(nèi)外血栓，明顯縮短纖維蛋白的溶解時(shí)間。納豆激酶經(jīng)口服后可迅速入血，纖溶活性強(qiáng)，作用時(shí)間長(zhǎng)，具有安全性好、口服有效等優(yōu)點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)對(duì)來源于納豆芽孢桿菌的納豆激酶基因進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的研究工作：
　　 1.采用CTAB法從納豆芽孢桿菌中提取基因組DNA，聚合酶鏈

2、式反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得約1024bp的片段。將目的基因與pET-30a質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Sal I雙酶切后，用T4DNA連接酶連接來構(gòu)建重組表達(dá)載體。將鑒定后的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni2+親合層析純化目的蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物分子量約為28KD。
　　 2.以純化的重組蛋白免疫家兔制備了納豆激酶多克隆抗體，經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化抗體，酶聯(lián)免疫吸附

3、試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)得抗體滴度約為1：8000，Westernblot結(jié)果顯示在約28KD處有一特異性條帶。方陣滴定法測(cè)得抗原最適包被濃度為20ug/ml。
　　 3.將純化后的納豆激酶抗體用辣根過氧化物酶標(biāo)記，建立了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法來檢測(cè)納豆激酶濃度。以納豆激酶標(biāo)準(zhǔn)品制備了標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密度試驗(yàn)結(jié)果良好，回收率測(cè)定結(jié)果表明檢測(cè)方法的回收率約為91％～102％。
　　 4.采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)法(ELISA)研究了納