文蛤(Meretrix meretrix)殼色花紋性狀的分子遺傳基礎(chǔ)研究.pdf

1、文蛤（Meretrix.meretrix）是我國沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟貝類，其豐富多彩的殼色花紋可以遺傳給后代，并且與生長、抗逆等經(jīng)濟性狀密切相關(guān)，一些色澤鮮艷的文蛤商業(yè)價值顯著提高。許多水生動物體色、殼色多態(tài)性的產(chǎn)生是由于體內(nèi)控制色素合成的基因發(fā)生變異，而且紅、黃體色的形成與自身類胡蘿卜素的含量密切相關(guān)，培育殼色艷麗的文蛤新品系對文蛤養(yǎng)殖業(yè)具有重要的意義。在表觀遺傳學研究中，DNA胞嘧啶甲基化現(xiàn)象影響著生物體表型的改變，是真核生物基因

2、組DNA修飾加工的方式之一。本研究以4個文蛤品系（紅殼、黑斑、白殼和細紋）為試驗材料，顯微觀察其外套膜色素帶并采用分光光度計法對紅殼和白殼文蛤外套膜中的類胡蘿卜素含量進行測定；從文蛤轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出類胡蘿卜素積累過程的兩個關(guān)鍵酶——GGPP合成酶（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPS）、β-胡蘿卜素加氧酶（beta,beta-carotene9',10'-oxygenase-like，c

3、rtO）的EST序列，利用RACE技術(shù)獲得了GGPS和crtO基因的cDNA全長，并利用qRT-PCR技術(shù)對GGPS和crtO基因在不同殼色文蛤（紅殼、粉紅殼、黑斑和白殼）外套膜、紅殼文蛤不同發(fā)育時期和不同組織中的表達量進行分析，試圖探究類胡蘿卜素在不同殼色文蛤外套膜中的沉積規(guī)律，為文蛤呈色機理的研究提供依據(jù)；此外，利用MSAP標記技術(shù)分析4種殼色文蛤甲基化差異，探索DNA甲基化和文蛤殼色之間的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
　　1.采

4、用顯微觀察法觀察紅殼和白殼文蛤外套膜色素帶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑斑個體的外套膜邊緣近貝殼面有一條較深的色素帶，而且在同一貝殼上黑斑區(qū)域的色素帶清晰，非黑斑區(qū)域無色素帶；紅殼個體的外套膜邊緣有一條紅色的色素帶，而白殼色個體沒有色素帶。分光光度法測定和 SPASS軟件分析發(fā)現(xiàn)，紅殼和白殼文蛤體內(nèi)總類胡蘿卜素含量存在極顯著差異，分別為1.703ug/100g和0.50ug/100g。
　　2.獲得了文蛤GGPP合成酶基因的cDNA全長序列，該c

5、DNA全長1130bp，開放閱讀框882bp，編碼293個氨基酸，推算分子量約為33.7kDr，理論等電點為6.64；氨基酸序列比對表明，其與非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）和海蝸牛（Aplysia californica）的序列有較高同源性，分別達到74.1％和73.7%；對其結(jié)構(gòu)預測顯示，該蛋白具有異戊二烯轉(zhuǎn)移酶中2個保守的特征結(jié)構(gòu)域（LLIDDIEDNSNLRRG和LGLYFQIRDDYAN）。crtO基因的cDN

6、A全長為2967bp，開放閱讀框1827bp，編碼608個氨基酸，推測分子量68.09kDa，理論等電點為5.58；該基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與雞（Gallus gallus）和綠海龜（Chrysemys picta bellii）的相似性分別為50.1%和45.5%。
　　3.利用qRT-PCR技術(shù)對GGPS和crtO基因在文蛤紅殼、粉紅殼、黑斑和白殼群體外套膜中的表達量進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GGPS和crtO基因在紅殼文蛤中

7、的表達量均最高，粉紅殼和黑斑次之，白殼最低，由此初步推測文蛤殼色的形成與體內(nèi)類胡蘿卜素相關(guān)。
　　GGPS基因和crtO基因在紅殼文蛤不同發(fā)育時期（卵子、細胞、囊胚、原腸胚、單輪期、眼點和稚貝）的表達量進行統(tǒng)計，GGPS基因和crtO基因在各發(fā)育時期均有表達，其中在眼點期的表達量極高，明顯區(qū)別于其他發(fā)育階段，另外，兩基因在各發(fā)育時期的表達量總體上呈現(xiàn)不統(tǒng)一的上調(diào)與下調(diào)交互的趨勢。GGPS在原腸胚和囊胚期的表達量基本相近，crtO基

8、因在囊胚和單輪期的表達量基本相近。到稚貝期，兩基因的表達量都較眼點略低，但GGPS的下降幅度遠大于crtO基因。GGPS基因和crtO基因在紅殼文蛤不同組織（鰓、外套膜、閉殼肌、足、內(nèi)臟團和水管）的表達量進行統(tǒng)計，GGPS基因和crtO基因在外套膜中的表達量顯著高于其它組織，并且GGPS基因在外套膜中的表達量又高于crtO基因。
　　4.利用MSAP分析技術(shù)對紅殼、黑斑、細紋和白殼4種殼色文蛤的甲基化水平及殼色差異性位點進行分析。