PRP誘導(dǎo)人BMSc體內(nèi)成骨及免疫配型不相合人BMSc混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、由創(chuàng)傷、感染、腫瘤等疾病引起的骨缺損是骨科臨床的常見病，骨缺損治療的難題主要是移植骨的來源問題。組織工程的興起和發(fā)展為骨缺損的修復(fù)開辟了一條新的途徑。骨組織工程技術(shù)以體外構(gòu)建、體內(nèi)重組的模式給這一領(lǐng)域提供了嶄新的治療技術(shù)手段，成為目前修復(fù)骨缺損的較為理想的方法。 [目的] 1.研究富血小板血漿對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，探討一種新的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，以滿足細(xì)胞培養(yǎng)過程中對(duì)各類細(xì)胞因子的需求，同時(shí)

2、盡量減少細(xì)胞培養(yǎng)過程中異源性抗原物質(zhì)的引入，達(dá)到組織工程骨臨床應(yīng)用中細(xì)胞數(shù)量與生物學(xué)特性的要求。 2.研究YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料對(duì)富血小板血漿誘導(dǎo)培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨特性的影響，探討誘導(dǎo)培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與珊瑚羥基磷灰石材料的生物相容性，以確立組織工程骨臨床應(yīng)用中所需的安全、有效的支架材料。 3.研究YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料與富血小板血漿誘導(dǎo)培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的成骨特性，并進(jìn)行相關(guān)安全性檢測

3、，探討采用誘導(dǎo)培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與珊瑚羥基磷灰石材料體內(nèi)異位成骨的方法及臨床應(yīng)用的可行性。 4.探討組織配型不相合人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(hBMSc)經(jīng)混合與誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞的生長情況，初步探討異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作為骨組織工程種子細(xì)胞應(yīng)用的可能性及建立“通用型”骨髓基質(zhì)干細(xì)胞庫的可行性。 [方法] 1.12名患有骨折需行手術(shù)取自體髂骨移植的志愿者，排除其他系統(tǒng)疾病并簽署同意。男性8名，女性4名，平均年齡27.5歲。

4、 2.富血小板血漿(PRP)的獲?。簩⒊槿〉淖泽w外周靜脈血200ml，加抗凝劑混勻，兩次離心。第一次在20℃，3600r/min離心10min。取上清及分界面下3mm部分置于另-離心管中，第2次在20℃，3600r離心15分鐘。棄上層3/4，剩余部分在漩渦振蕩器上輕振蕩使混勻，即為富血小板血漿。將富血小板血漿與催化劑溶液(含100g/L氯化鈣、400IU/ml凝血酶)以體積比9∶1混合，混勻后以0.22μm濾膜過濾即為富血小板血漿

5、復(fù)合因子萃取液。 3.人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)：12名志愿者隨即分為兩組，每組6人。實(shí)驗(yàn)組志愿者需提前提取自體的富血小板血漿并作好標(biāo)記。無菌條件下抽取骨髓5ml。密度梯度離心法獲取有核細(xì)胞，接種于10cm2培養(yǎng)瓶。實(shí)驗(yàn)組采用培養(yǎng)基為細(xì)胞來源個(gè)體的自體10％富血小板血漿配比高糖DMEM培養(yǎng)基加青霉素、鏈霉素各100μ/ml；對(duì)照組采用培養(yǎng)基為10％胎牛血清配比高糖DMEM培養(yǎng)基加青霉素、鏈霉素各100μ/ml。置于37℃，5％

6、CO2孵育箱中，相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。原代培養(yǎng)9天后，胰蛋白酶消化并進(jìn)行傳代誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)采用50ug/ml抗壞血酸、10-8mol/L地塞米松、10-3mol/Lβ-甘汕磷酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)基，根據(jù)分組不同配比10％自體富血小板血漿或10％胎牛血清。通過相差顯微鏡、掃描電鏡及特殊染色的方法對(duì)比觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞的生長情況與形態(tài)學(xué)變化；采用MTT法及堿性磷酸酶活性與細(xì)胞骨鈣素含量測定對(duì)比兩組的細(xì)胞增值情況與生物學(xué)特性。

7、 4.人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料復(fù)合：采用上述以自體富血小板血漿誘導(dǎo)培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(細(xì)胞的獲取、分離、原代培養(yǎng)及傳代誘導(dǎo)培養(yǎng)方法同上)。細(xì)胞培養(yǎng)至第3代，消化并收集細(xì)胞。將北京意華健公司的YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料切割成0.5×1×1cm大小塊狀并進(jìn)行滅菌處理后，以種植密度為5×106將誘導(dǎo)培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與珊瑚羥基磷灰石材料復(fù)合培養(yǎng)。以人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)而不與材料復(fù)合作為

8、對(duì)照，通過相差顯微鏡、掃描電鏡對(duì)比觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞的生長情況與形態(tài)學(xué)變化；采用MTT法對(duì)比兩組的細(xì)胞增值情況；采用考馬斯亮藍(lán)法測定細(xì)胞微量蛋白及堿性磷酸酶活性測定判定北京意華健公司的YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料對(duì)富血小板血漿誘導(dǎo)培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響。 5.富血小板血漿誘導(dǎo)培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成骨：以自體富血小板血漿誘導(dǎo)培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(細(xì)胞的獲取、分離、原代培養(yǎng)及傳代誘導(dǎo)培養(yǎng)方法同上)。細(xì)胞

9、培養(yǎng)至第3代，消化并收集細(xì)胞。將北京意華健公司的YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料切割成0.5×1×1cm大小塊狀并進(jìn)行滅菌處理后，以種植密度為5×106將誘導(dǎo)培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與珊瑚羥基磷灰石材料復(fù)合培養(yǎng)。14只裸鼠隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組將人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與珊瑚羥基磷灰石材料復(fù)合培養(yǎng)3天后的復(fù)合物手術(shù)植入裸鼠肌袋內(nèi)；對(duì)照組只采用珊瑚羥基磷灰石材料手術(shù)植入裸鼠肌袋內(nèi)。分別與4、8、12周對(duì)裸鼠進(jìn)行大體觀察、X線觀察并按照分組情況分批次處死

10、裸鼠，取組織切片并HE染色觀察成骨情況。 6.組織配型不相和人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)：12名志愿者根據(jù)組織配型情況將配型不相和志愿者配對(duì)，共配成6對(duì)。采用上述方法分別抽取骨髓，細(xì)胞的獲取、分離及原代培養(yǎng)方法同上，只是原代培養(yǎng)采用10％AB型血清配比高糖DMEM培養(yǎng)基。傳代培養(yǎng)按照1∶2傳代，根據(jù)配對(duì)情況分別采用混合培養(yǎng)與混合誘導(dǎo)培養(yǎng)。混合培養(yǎng)組繼續(xù)采用10％AB型血清配比高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)；混合誘導(dǎo)培養(yǎng)組采用含10％A

11、B血清配比高糖DMEM培養(yǎng)基并添加50ug/ml抗壞血酸、10-8mol/L地塞米松、10-3mol/Lβ-甘油磷酸鈉進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。采用倒置相差顯微鏡及MTT法對(duì)比研究兩組細(xì)胞與單個(gè)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)、生長情況及增值等生物學(xué)特性。 [結(jié)果] 1.人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果：采用富血小板血漿與采用胎牛血清誘導(dǎo)培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)相差不明顯。BMSc接種后12～24h開始貼壁，細(xì)胞貼壁后逐漸變形呈多角形、梭

12、型。6～8天后，細(xì)胞可長滿瓶底并呈現(xiàn)單層細(xì)胞融合。傳代培養(yǎng)后細(xì)胞生長迅速，接種細(xì)胞2～4天可長滿瓶底。細(xì)胞為長梭型或不規(guī)則多邊形，并由偽足伸出，胞核位于細(xì)胞一端。第3代細(xì)胞培養(yǎng)融合后，繼續(xù)培養(yǎng)至形成密集的細(xì)胞團(tuán)簇，中心出現(xiàn)細(xì)胞基質(zhì)的沉積，硒素紅染色可以清晰的顯示鈣結(jié)節(jié)；堿性磷酸酶染色可見胞質(zhì)內(nèi)有大量灰黑色顆?；驂K狀沉淀，呈現(xiàn)堿性磷酸酶染色陽性。細(xì)胞生長至第8代生長明顯變緩，10代以后細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)顆粒樣沉淀物，并由細(xì)胞脫落飄浮于液體中。

13、掃描電鏡觀察，黏附細(xì)胞為梭型或多角形表現(xiàn)，并有多個(gè)突起呈不規(guī)則形狀。誘導(dǎo)培養(yǎng)3d可測得堿性磷酸酶(ALP)活性及細(xì)胞骨鈣素含量，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)與培養(yǎng)時(shí)間的延長，ALP活性與骨鈣素含量增加。 2.北京意華健公司YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料：多孔，孔隙相通，孔徑范圍280～370μm，平均325μm。與材料復(fù)合培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合后，12～24h可見到細(xì)胞開始與材料黏附，并開始伸出偽足成多角形附著于材料表面，在孔隙內(nèi)沿材料的壁

14、貼附，有多個(gè)突起，沿展性好。隨時(shí)間延長材料表面黏附細(xì)胞增多，材料周邊細(xì)胞增殖速度及形態(tài)未受到明顯影響。細(xì)胞微量蛋白含量與堿性磷酸酶測定顯示單純細(xì)胞培養(yǎng)組與細(xì)胞材料復(fù)合培養(yǎng)組人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞微量蛋白含量無明顯差異，且均隨時(shí)間的延長而含量增加。 3.體外誘導(dǎo)培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與珊瑚羥基磷灰石復(fù)合植入裸鼠肌袋術(shù)后4周，可見珊瑚羥基磷灰石表面有細(xì)胞生長，珊瑚羥基磷灰石孔隙內(nèi)有結(jié)締組織長入；X線檢查可見少量照射遮擋，組織學(xué)觀察可將

15、少量骨形成。術(shù)后8周，珊瑚羥基磷灰石表面可見新生骨形成，孔隙內(nèi)和孔隙邊緣可見骨樣組織沉積和少量軟骨樣組織形成；X線檢查可見明顯照射遮擋。術(shù)后12周，珊瑚羥基磷灰石材料表面可見有較多成熟編制骨形成，部分區(qū)域可見髓腔樣結(jié)構(gòu)形成，并有血管長入。 4.混合培養(yǎng)組與單個(gè)培養(yǎng)組細(xì)胞生長情況無明顯差別，生長迅速，接種細(xì)胞2～3d可長滿瓶底。細(xì)胞呈梭形、多角形，胞漿淡藍(lán)色，核卵圓形，可見數(shù)個(gè)深藍(lán)色的核仁?；旌险T導(dǎo)培養(yǎng)組24h內(nèi)細(xì)胞能較快的擴(kuò)增，

16、細(xì)胞形態(tài)與混合培養(yǎng)組差異不明顯；48h后細(xì)胞大量凋亡，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，72h后細(xì)胞減少殆盡，培養(yǎng)瓶內(nèi)很難見到正常生長的細(xì)胞，僅存的細(xì)胞形態(tài)皺縮，趨于細(xì)胞凋亡形態(tài)。 [結(jié)論] 1.自體富血小板血漿能有效的促進(jìn)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖及分化，促進(jìn)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨特性的表達(dá)；自體富血小板血漿替代動(dòng)物血清誘導(dǎo)培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可作為骨組織工程臨床應(yīng)用的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。 2.珊瑚羥基磷灰石材料對(duì)富血小板血漿誘導(dǎo)培養(yǎng)

17、人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生長增殖及成骨特性無明顯影響；YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料與人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有良好的生物相容性，其生物學(xué)特性基本符合骨組織工程的要求，可用于進(jìn)一步骨組織工程相關(guān)研究。 3.富血小板血漿誘導(dǎo)培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與北京意華健公司的珊瑚羥基磷灰石材料在裸鼠體內(nèi)能夠良好的成骨，隨時(shí)間的延長，成骨特性越明顯；(2)體內(nèi)采用肌袋包裹的方法能有效的增加血運(yùn)及促進(jìn)組織工程骨血管化的生成，促進(jìn)成骨；本實(shí)驗(yàn)所采用的富血小板血漿誘