人乳牙牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及裸鼠體內(nèi)成骨的初步研究.pdf

1、背景和目的: 乳牙牙髓干細(xì)胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）具有來源廣泛安全、取材方便、免疫排斥較小等優(yōu)點(diǎn)，并具有高度的克隆形成能力及多向分化潛能。有實(shí)驗(yàn)證明SHED可被誘導(dǎo)分化成多種組織，包括牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)、骨組織、脂肪組織和神經(jīng)組織等。SHED還可能具有一定的誘導(dǎo)成骨能力。以上生物學(xué)特性使得SHED成為一種極具應(yīng)用潛力的組織工程種子細(xì)胞。 目

2、前，SHED的研究處于起步階段，特別是國內(nèi)的報(bào)道非常少。本課題旨在探索出一種培養(yǎng)該細(xì)胞行之有效的方法，通過對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的觀察、表型分析及體外誘導(dǎo)分化、體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)，明確其干細(xì)胞身份，探討SHED的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行。第一部分內(nèi)容，首先從健康兒童滯留乳牙中分離培養(yǎng)出SHED，形態(tài)學(xué)觀察、克隆形成率測(cè)定、細(xì)胞周期分析，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)和細(xì)胞免疫組化方法分析其免疫表型和蛋白表達(dá)情況。并于體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，觀察其礦化和向脂肪細(xì)胞分化的

3、能力。實(shí)驗(yàn)的第二部分，將SHED與β-磷酸三鈣（β-TCP）于體外復(fù)合培養(yǎng)，掃描電鏡觀察細(xì)胞與材料貼合的情況，隨后將復(fù)合材料移植到裸鼠肌肉中繼續(xù)觀察，并在不同時(shí)期解剖裸鼠，行大體觀察和免疫組織化學(xué)切片染色，觀察SHED于裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)行為，為SHED的進(jìn)一步研究和利用提供參考依據(jù)。 第一部分、SHED的培養(yǎng)和鑒定。 一、方法： 1. SHED的收集和培養(yǎng)。 選取6～10歲健康兒童的滯留乳牙，采用酶消化法

4、培養(yǎng)細(xì)胞。拔取牙髓組織，消化、過濾得到細(xì)胞懸液，鋪瓶培養(yǎng)。 2. 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)。 在6孔板中按100個(gè)細(xì)胞吼的密度接種第2代細(xì)胞，培養(yǎng)單克隆細(xì)胞群。 3. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。 觀察原代和傳代細(xì)胞生長、增殖情況及形態(tài)特征，HE染色觀察第3代細(xì)胞組織學(xué)特征。 4. 細(xì)胞周期檢測(cè)。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)第2代SHED各時(shí)相細(xì)胞比例。 5. 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞膜抗原。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)第

5、2代SHED CD90、CD44、STRO-1抗原及第12代細(xì)胞STRO-1抗原表達(dá)。 6. 堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的表達(dá)。 分別將第3代和第13代細(xì)胞行細(xì)胞免疫化學(xué)分析，觀察bFGF的表達(dá)，并比較不同代細(xì)胞染色結(jié)果差異。 7. 成脂分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。 第2代細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)液條件下培養(yǎng)，觀察到脂滴形成后行油紅-O染色。 8. 礦化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。 第2代細(xì)胞在礦化誘導(dǎo)液條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)

6、胞出現(xiàn)礦化后終止培養(yǎng)、茜素紅染色。 二、結(jié)果： 1. SHED的分離和培養(yǎng)。 細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)天后呈克隆樣生長，形態(tài)呈現(xiàn)多形性，隨著傳代次數(shù)增多，細(xì)胞的多形性逐漸減低，并較多呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，胞體變大，顏色變深，大小、形態(tài)趨近一致。 2. 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)。 克隆形成效率為16～18/103細(xì)胞。 3. 細(xì)胞HE染色觀察。 第3代細(xì)胞爬片HE染色：大部分細(xì)胞呈短梭形，少量細(xì)胞呈多角

7、形，輪廓清。細(xì)胞體積小，胞核深染、卵圓形或圓形。胞核體積大，內(nèi)可見一個(gè)或多個(gè)核仁。胞漿著色淺。 4. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。 第2代細(xì)胞周期顯示絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期（73.6%），即靜止期及DNA合成前期。G2/M期比例為5.3%，S期細(xì)胞比例為21.1%。S期細(xì)胞的比例（SPF）較高。 5. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。 用第2代細(xì)胞CD90、CD44表達(dá)率分別為99.1%和99.9%，STR

8、O-1陽性率為25.4%，第12代細(xì)胞STRO-1含量僅為1.4%。 6. 免疫組化染色檢測(cè)bFGF表達(dá)。 第3代、第13代細(xì)胞爬片免疫組化染色觀察可見都表達(dá)陽性結(jié)果。 7. 體外誘導(dǎo)分化成脂實(shí)驗(yàn)。 第2代細(xì)胞成脂誘導(dǎo)體系作用下，約15d觀察到個(gè)別細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)高強(qiáng)度折射點(diǎn)，20d左右可見串珠樣透明高亮度點(diǎn)增多，并有部分融合，油紅-O染色呈陽性。 8. 體外誘導(dǎo)礦化實(shí)驗(yàn)。 第2代細(xì)胞在礦化

9、誘導(dǎo)體系的作用下約第8～9d可以見疊加生長，細(xì)胞透光性變差，15d左右部分細(xì)胞聚集成散在的片狀，28d時(shí)結(jié)節(jié)較多，行茜素紅染色后呈陽性。 三、結(jié)論： 1. SHED具有很強(qiáng)的增殖力和克隆形成能力。細(xì)胞形態(tài)學(xué)與細(xì)胞的種類及分化水平密切相關(guān)，可以作為細(xì)胞鑒定的參考指標(biāo)。 2. STRO-1可作為SHED鑒定的抗原之一， CD90、CD44、bFGF對(duì)SHED的鑒定沒有意義。 3. SHED在體外經(jīng)誘導(dǎo)具有向脂

10、肪細(xì)胞分化的潛能，也可以經(jīng)誘導(dǎo)發(fā)生礦化。 4. 未經(jīng)純化的高細(xì)胞濃度SHED體外培養(yǎng)可以發(fā)生類似礦化樣的改變，但不經(jīng)誘導(dǎo)無法形成鈣結(jié)節(jié)。 第二部分、SHED與β-磷酸三鈣復(fù)合物在裸鼠體內(nèi)成骨的初步研究。 一、方法： 1. 細(xì)胞原代培養(yǎng)。 同實(shí)驗(yàn)第一部分。 2. SHED與β-磷酸三鈣（β-TCP）體外復(fù)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。 本課題的實(shí)驗(yàn)材料為SHED與β-TCP的復(fù)合培養(yǎng)物，對(duì)照材料為單純

11、的β-TCP。將β-TCP顆粒置于96孔板中，共43顆（實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各用20顆，另有3顆做掃描電鏡觀察）。選取第2代SHED消化、計(jì)數(shù)，分別在23個(gè)含有β-TCP顆粒的孔洞內(nèi)加入2×106個(gè)細(xì)胞，注滿培養(yǎng)基，每12小時(shí)換液。在剩余的含β-TCP顆粒的20個(gè)孔洞內(nèi)加純培養(yǎng)基，作為對(duì)照組同期觀察。 3. 掃描電鏡觀察。 在SHED復(fù)合β-TCP后的第1、3、5天，分別各取1顆復(fù)合培養(yǎng)物，行掃描電鏡觀察并照相，觀察細(xì)胞與材料

12、貼附情況。 4. 裸鼠肌袋內(nèi)移植觀察實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：20只裸鼠隨機(jī)分為三組，每組6只，余2只作為實(shí)驗(yàn)替補(bǔ)同期觀察。每只裸鼠于雙側(cè)后腿肌袋分別植入實(shí)驗(yàn)材料和對(duì)照材料，雙側(cè)對(duì)照觀察。 5. 取材分析。 分別于第2、4、8周解剖裸鼠，觀察移植物局部組織毗鄰的相互關(guān)系。組織塊行HE染色，免疫組化檢測(cè)牙本質(zhì)涎蛋白（DSP）表達(dá)情況。 二、結(jié)果： 1. SHED與β-TCP復(fù)合培養(yǎng)體的電鏡觀察。

13、 β-TCP由眾多球形材料聚合而成，有均勻分布的孔型，孔壁光滑，細(xì)胞在第1天就吸附于材料表面，仍具有典型的多形性形態(tài)，可見細(xì)胞突起連接、重疊生長等特征。細(xì)胞在第5天已經(jīng)延展成片狀，牢固吸附于材料表面。 2. 實(shí)驗(yàn)取材和檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)所用20只裸鼠，觀察期間死亡4只，另有3只傷口感染。健康的裸鼠分別于第2、4周各解剖5只，第8周解剖3只行大體觀察和組織學(xué)染色。可見移植物與肌肉組織的緊密貼合，HE染色顯示移植材料在第2

14、、4周有大量纖維組織長入，伴有小血管進(jìn)入，移植材料開始降解。實(shí)驗(yàn)組材料到第4周時(shí)，仍沒有明顯的成骨或礦化現(xiàn)象。第8周3只裸鼠的實(shí)驗(yàn)組移植物經(jīng)組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)1塊含有形態(tài)學(xué)特征明確的軟骨化骨，軟骨基質(zhì)透明，軟骨細(xì)胞位于基質(zhì)內(nèi)陷窩中，細(xì)胞核呈橢圓形，陷窩周圍有染色較深的軟骨囊。另2塊移植物內(nèi)未發(fā)現(xiàn)軟骨化骨結(jié)構(gòu)。對(duì)照組移植物在各期都未發(fā)現(xiàn)礦化和成骨現(xiàn)象。所有標(biāo)本牙本質(zhì)涎蛋白（DSP）組化染色呈陰性。 三、結(jié)論： 1. 在體外，