華支睪吸蟲(chóng)Rho GTPase基因的發(fā)現(xiàn)及其功能的初步研究.pdf

1、華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchissinensis,Cs)，又稱肝吸蟲(chóng)(liverfluke)，寄生在人和多種哺乳動(dòng)物的肝膽管內(nèi)，可引起膽管局限性擴(kuò)張、膽管上皮增生、膽管炎、肝硬化甚至誘發(fā)肝膽管腫瘤。全世界將近3500萬(wàn)人感染華支睪吸蟲(chóng)，我國(guó)目前感染人數(shù)為1249萬(wàn)，分布在除西北幾個(gè)省區(qū)外的25個(gè)省市，且呈上升之勢(shì)，成為我國(guó)一個(gè)比較嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。 因此，華支睪吸蟲(chóng)病的防治及相關(guān)的基礎(chǔ)研究受到了政府和研究機(jī)構(gòu)的日益重視，通過(guò)對(duì)

2、華支睪吸蟲(chóng)基因組和功能基因組的研究尋找有價(jià)值的診斷和疫苗候選分子成為華支睪吸蟲(chóng)病綜合防治的基礎(chǔ)。 本研究從全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中挑選出來(lái)一個(gè)免疫診斷和疫苗候選分子—華支睪吸蟲(chóng)RhoGTPase基因。RhoGTPase為一群分子量接近和同源性較高的蛋白，它們廣泛存在于人類(lèi)、動(dòng)物、植物以及真菌等生物體內(nèi)，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器或分子開(kāi)關(guān)，作用于靶蛋白而產(chǎn)生細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡等多種生物效應(yīng)。在所有的真核生

3、物中，這群高度保守的基因在錯(cuò)綜復(fù)雜的生化網(wǎng)絡(luò)中控制著細(xì)胞生物活動(dòng)的基本過(guò)程：形態(tài)、極化、運(yùn)動(dòng)和分裂等等。 華支睪吸蟲(chóng)RhoGTPase基因首先在本實(shí)驗(yàn)室被克隆和表達(dá)，對(duì)其功能和應(yīng)用方面的研究國(guó)內(nèi)外都未見(jiàn)報(bào)道。 研究目的根據(jù)對(duì)CsRhoGTPase基因全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)分析，進(jìn)行克隆、表達(dá)和免疫學(xué)功能初步研究，探討CsRhoGTPase在華支睪吸蟲(chóng)病診斷和防治上的意義。 研究方法1華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)CsRhoGTPa

4、se基因及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能分析從華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中選擇CsRhoGTPase基因，克隆號(hào)為CS007c11。利用生物信息學(xué)分析軟件(包括BLASTx、RPS-BLAST、InterProScan、ProtPearamtool等)對(duì)CsRhoGTPase的cDNA序列和氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，包括核酸水平和氨基酸水平的同源性分析，以及推導(dǎo)的CsRhoGTPase蛋白的理化性質(zhì)及一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)抗原表位，

5、根據(jù)分析結(jié)果確定表達(dá)策略。 2華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)CsRhoGTPase基因的擴(kuò)增、克隆和表達(dá) 2.1華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)CsRhoGTPase基因的擴(kuò)增、克隆根據(jù)目的基因的ORF和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增CsRhoGTPase基因的cDNA全長(zhǎng)編碼區(qū)。用定向克隆方法將其編碼區(qū)cDNA序列連接到質(zhì)粒pET-30a(+)中，用PCR、酶切及測(cè)序鑒定。 2.2重組蛋白的表達(dá)純化將重組質(zhì)粒pET-30a

6、(+)-CsRhoGTPase轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)，用SDS-PAGE鑒定是否有融合蛋白表達(dá)，親和層析獲得純化的CsRhoGTPase重組蛋白。 3CsRhoGTPase重組蛋白的免疫學(xué)功能初步研究 3.1CsRhoGTPase重組蛋白的免疫反應(yīng)性鑒定將獲得的CsRhoGTPase蛋白，通過(guò)SDS-PAGE電泳和Westernblot方法，一抗用感染華支睪吸蟲(chóng)的貓血清(1：100稀釋)觀察感染血清對(duì)

7、重組蛋白的識(shí)別能力。 3.2CsRhoGTPase重組蛋白的免疫原性及抗Cs囊蚴的攻擊感染初步研究：用CsRhoGTPase重組蛋白免疫SD大鼠，經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫后用Cs囊蚴攻擊感染，查見(jiàn)Cs蟲(chóng)卵后處死大鼠，與對(duì)照組比較成蟲(chóng)數(shù)、蟲(chóng)卵數(shù)的差異。取血清用ELISA法進(jìn)行血清抗體水平鑒定。 研究結(jié)果1華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)CsRhoGTPase基因及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能分析CsRhoGTPase全長(zhǎng)基因?yàn)?68bp，ORF從第1

8、12bp到第688bp，起始密碼子為ATG、終止密碼子為T(mén)AA，完整閱讀框含576bp，根據(jù)Blastx分析，該ORF就是其完整的CDS，編碼192aa，理論分子量為21，700，pI=7.55(圖1)。BLASTP分析表明，該基因序列與人RhoAGTPase的一致性為70％，同源性為82％；與曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosomamansoni)和日本血吸蟲(chóng)(Schistosomajaponicum)的RhoA基因序列一致性分別為66％和

9、68％。同源性分別為79％和80％，并具有與人和其他真核生物RhoGTPases家族一致的特征性序列(GTP酶活性域、Rho插入域及C末端CAAX模序等)，初步判定該基因?yàn)槿A支睪吸蟲(chóng)RhoGTPase樣基因。 2華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)CsRhoGTPase基因的擴(kuò)增、克隆和表達(dá)用設(shè)計(jì)的引物PCR從質(zhì)粒cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增CsRhoGTPase編碼區(qū)cDNA序列，用瓊脂糖電泳鑒定在微大于500bp處，測(cè)序確定為576bp。定向克隆獲得的重組

10、原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-CsRhoGTPase經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在IPTG終濃度1mmol/L，37℃下誘導(dǎo)表達(dá)可溶性重組融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE顯示與理論預(yù)測(cè)的融合蛋白分子量約30,000相符。 3CsRhoGTPase重組蛋白的免疫學(xué)功能初步研究Westernblot證實(shí)自然感染華支睪吸蟲(chóng)的貓血清能識(shí)別原核表達(dá)的CsRhoGTPase蛋白。初步研究表明，CsRhoGTPase重組蛋白免