失血性休克大鼠肝臟差民基因的篩查及EPHX2基因表達(dá)的初步研究.pdf

1、背景及目的：
　　 即使是相同種屬、相同性別、相同周齡、相同體重及相同營養(yǎng)狀況的大鼠,其對特定程度的失血所引起的失血性休克的耐受能力是截然不同的,只有少數(shù)大鼠可以經(jīng)受住這個病理過程并存活下來,這其中是否有基因方面的差異在起關(guān)鍵作用呢?本實(shí)驗(yàn)的目的就是試圖通過基因芯片技術(shù)篩查出與休克發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因并在mRNA及蛋白水平進(jìn)行初步驗(yàn)證,從中發(fā)現(xiàn)并選擇出潛在的關(guān)鍵性基因作為進(jìn)一步研究對象,檢測其在休克前后及復(fù)蘇后不同時段肝臟中表

2、達(dá)的差異,分析其可能的作用機(jī)制,為進(jìn)一步的研究做出初步探索。
　　 方法：
　　 第一部分:休克相關(guān)背景基因的篩查:建立左肝外葉切除一定容失血性休克大鼠模型,放血前切除大鼠肝臟左外葉留取標(biāo)本作為背景,嚴(yán)格標(biāo)化放血前的手術(shù)操作過程,按2.5ml/100g的失血比例、2.0ml.Kg-1.min-1的速率放血,將存活組與死亡組大鼠的術(shù)前肝臟及存活組大鼠的術(shù)后24h肝臟取出行cDNA基因芯片篩查,找出差異基因,通過RT—PCR

3、驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)的可信性.利用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(KEGG)分析差異基因間的相互聯(lián)系,利用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析,選擇目的基因分析其上游的核轉(zhuǎn)錄基因,為進(jìn)一步的檢測做準(zhǔn)備.
　　 第二部分:檢測EPHX2、YY1在休克大鼠肝臟中的表達(dá):建立定壓失血性休克一復(fù)蘇大鼠模型,將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為對照組、休克不復(fù)蘇組(HS)、復(fù)蘇后1h組(HSR1)、復(fù)蘇后3h組(HSR3)、復(fù)蘇后6h組(HSR6),放血至大鼠平均動脈壓(MAP)降至30±5mmHg并

4、在此水平下維持1h,復(fù)蘇組在休克維持1h后予以1/2自身全血+3/2乳酸林格氏液15分鐘內(nèi)復(fù)蘇,通過rt-PCR及Western blotting技術(shù)檢測各組肝臟組織中EPHX2和YY1的基因和蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:在同樣2.5ml/100g的比例、2.0ml.Kg-1.min-1的速率條件下失血的大鼠定容失血性休克+肝左外葉切除模型中,大鼠的生存率在50％左右,在總共21793個大鼠基因中存活

5、組與死亡組術(shù)前相比較有100個差異基因(fold>2),其中上調(diào)基因47個,下調(diào)基因53個,這些差異基因的功能分析顯示其多與生物節(jié)律、β-丙胺酸代謝、組氨酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、甘氨酸-絲氨酸-組氨酸代謝、維生素B6代謝、精氨酸和蘇氨酸代謝相關(guān)。Aldh1a7、Aoc3、Cyp26a1、HDC和EPHX2基因的RT-PCR檢測顯示其與芯片檢測結(jié)果相符。在這些差異基因中,EPHX2基因在存活組的含量低于死亡組,我們將其做為目的基因

6、做進(jìn)一步的檢測。
　　 第二部分:在定壓失血性休克+復(fù)蘇的大鼠模型中發(fā)現(xiàn),與對照組相比,在肝臟中,EPHX2在休克維持期1h末(HS組)明顯增高(P<0.05),予以復(fù)蘇后,隨著復(fù)蘇時間的推移,EPHX2在1h(HSR1組)、3h(HSR3組)、6h(HSR6組)逐漸降低,其中HS組與HSR1組、HSR1組與HSR3組差異明顯(P<0.05),HSR3組與HSR6組差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。與之相對應(yīng)的,核轉(zhuǎn)錄因子YY1的變化趨勢與

7、EPHX2呈相反的變化,提示其對EPHX2可能起到一個負(fù)調(diào)控的作用。
　　 結(jié)論：
　　 本次實(shí)驗(yàn)為休克發(fā)生發(fā)展的研究提供了一個不同的視角,即從原始背景的角度在基因水平尋找差異。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了不同的大鼠即使在相同的實(shí)驗(yàn)條件下其抗休克的能力是顯著不同的,這可能與自身基因的差異有關(guān)。EPHX2的升高與休克大鼠肝細(xì)胞的凋亡有關(guān),核轉(zhuǎn)錄因子YY1做為EPHX2的上游基因?qū)ζ溆胸?fù)相調(diào)控作用,對YY1的擴(kuò)增可能對大鼠的抗休克有保護(hù)作用。