基于磁性復(fù)合顆粒和化學(xué)發(fā)光的乙肝分子檢測方法的建立及優(yōu)化.pdf

1、乙型病毒性肝炎感染是一個全球性的問題，乙肝病毒分子診斷對于乙肝疾病的預(yù)防和治療具有重大的意義。磁性納米顆粒作為納米材料的一個重要組成部分，由于其在緩沖體系中具有高比表面積和易分離的特點，目前已被廣泛應(yīng)用于各種生物信號的檢測等方面。化學(xué)發(fā)光具有安全、靈敏度高，線性范圍寬等特點，為病毒分子檢測提供了一個良好的平臺。本論文結(jié)合磁性復(fù)合顆粒和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的優(yōu)點，建立了一種快速靈敏的乙肝病毒分子檢測新方法。具體內(nèi)容包括：
　　1.溶劑熱法磁

2、性復(fù)合顆粒的制備
　　制備出粒徑均勻，分散性良好的Fe3O4顆粒，并在顆粒表面包被SiO2便于進行功能化基團修飾。獲得的Fe3O4/SiO2磁性復(fù)合顆粒為核殼結(jié)構(gòu)的球形實心均勻顆粒，粒徑范圍為500-600 nm。
　　2.磁性復(fù)合顆粒全血核酸提取法與血清煮沸裂解法乙肝病毒核酸提取效果的比較
　　磁性復(fù)合顆粒吸附核酸提取法是通過顆粒的磁分離和高比表面積特性對核酸分子進行快速吸附和分離，避免了離心等繁瑣步驟，通過多次清洗

3、，可以有效去除抑制擴增的雜質(zhì)成分，適合于自動化操作。通過磁性復(fù)合顆粒全血核酸提取法與血清煮沸裂解法兩種方法對乙肝病毒核酸提取效果的對比實驗發(fā)現(xiàn)，磁性復(fù)合顆粒全血核酸提取法提取出的核酸純度較血清煮沸裂解法高，因此采用顆粒吸附核酸提取法作為本研究中乙肝病毒核酸樣本的制備方法。
　　3.基于磁性復(fù)合顆粒的化學(xué)發(fā)光乙肝病毒模擬片段雜交檢測方法的建立及優(yōu)化
　　利用Fe3O4/SiO2磁性復(fù)合顆粒作為固相載體，表面修飾特異性乙肝病毒基

4、因探針，雜交捕獲生物素標記的乙肝病毒模擬核酸片段ssHBV-DNA，與修飾有堿性磷酸酶的鏈親合素(streptavidin-ALP)結(jié)合，充分洗滌后加入3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3”-羥基)苯-1，2-二氧雜環(huán)丁烷磷酸(3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3”-phosphoryloxy)phenyl-1，2-dioxetane，AMPPD)，通過化學(xué)發(fā)光讀板機讀取每孔的發(fā)光強度，實

5、現(xiàn)了快速特異分析鑒定。隨后對相關(guān)實驗條件進行優(yōu)化分析，結(jié)果表明，乙肝病毒模擬片段檢測靈敏度可達1copy/mL，在低濃度范圍10-10000 copies/mL內(nèi)，發(fā)光信號強度呈良好的線性關(guān)系。
　　4.基于磁性復(fù)合顆粒富集，生物素信號放大和化學(xué)發(fā)光的乙肝病毒分子檢測新方法的建立及優(yōu)化
　　通過摻入生物素標記的單體，對磁性顆粒提取的乙肝病毒核酸樣本進行擴增標記，利用乙肝病毒模擬片段建立的化學(xué)發(fā)光檢測優(yōu)化方法，對擴增片段進行檢