3-氨基苯甲酰胺（3-AB）對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠脊髓打擊傷的神經(jīng)保護(hù)的研究.pdf

1、脊髓損傷(SCI)是一種在平時(shí)或戰(zhàn)時(shí)都很常見的嚴(yán)重的損傷，可引起患者的肢體運(yùn)動(dòng)、感覺及括約肌功能障礙，甚至死亡。隨著工業(yè)化及交通事業(yè)的發(fā)展，脊髓損傷在近年有增多的趨勢(shì)。因此，加強(qiáng)對(duì)脊髓損傷的及時(shí)治療，特別是防止脊髓繼發(fā)性損傷，以減少嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙的發(fā)生是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。原發(fā)性脊髓損傷激發(fā)的一系列病理因素與組織進(jìn)行性破壞過程稱脊髓繼發(fā)性損傷。大多發(fā)生在損傷后4-6小時(shí)之內(nèi)，多有脊髓中心性缺血、出血和壞死。20年來，隨著對(duì)SCI病理基

2、礎(chǔ)及其分子機(jī)制研究的深入，藥物治療SCI在預(yù)防脊髓繼發(fā)性損傷過程中顯示積極有效的作用。近幾年，有關(guān)聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)在神經(jīng)損傷中的作用的實(shí)驗(yàn)性報(bào)道不斷增多。PARP是廣泛存在于有核細(xì)胞中的多功能酶，是一種豐富的核蛋白。PARP對(duì)維持細(xì)胞的正常功能具有極為重要的作用，其異?？赡芷鋵?dǎo)致細(xì)胞死亡的因素之一。因此，如何使PARP在神經(jīng)損傷中發(fā)揮正常保護(hù)作用并減少損傷作用，目前已成為熱門科研題目之一。3-氨基苯甲酰胺(3-AB)是

3、一種選擇性的PARP抑制劑，其可以減少脊髓損傷后的興奮性氨基酸及一氧化氮的釋放，抑制PARP的耗氧及耗能，降低神經(jīng)細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)證明，低劑量3-AB可暫時(shí)非完全性抑制PARP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷而起到神經(jīng)保護(hù)作用，但多為3-AB在腦缺血性損傷中的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，有關(guān)在脊髓神經(jīng)保護(hù)方面未見報(bào)道。 目的：通過對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠脊髓損傷后的后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，脊髓損傷段病理評(píng)分和PARP活性的Westernblot檢測(cè)，以及應(yīng)用抑制劑前后的對(duì)比，檢

4、測(cè)PARP在脊髓損傷中的表達(dá)規(guī)律，評(píng)估3-AB在脊髓損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用，為脊髓損傷的臨床藥物治療提供新的理論依據(jù)。 方法：1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組：健康SD大鼠90只，體重200-250g，隨機(jī)分五組。A：正常對(duì)照組(18只)：咬除椎板后正常飼養(yǎng)。B：損傷對(duì)照組：B1：損傷后即經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水(6只)；B2：損傷后6小時(shí)注射生理鹽水(6只)；B3：損傷后24小時(shí)注射生理鹽水(6只)。C：3-AB10mg/kg治療組：C1：損傷后

5、給藥(6只)；C2：損傷后6小時(shí)給藥(6只)；C3：損傷后12小時(shí)給藥(6只)。D：3-AB20mg/kg治療組：給藥方式同C。E：3-AB30mg/kg治療組：給藥方式同C。3-AB經(jīng)尾靜脈注射。B、C、D、E各組動(dòng)物分別于經(jīng)尾靜脈給藥或生理鹽水后觀察24小時(shí)后處死；A組動(dòng)物分3組(n=6)，分別于相對(duì)應(yīng)的時(shí)間處死以作對(duì)照。2。改良ALLEN脊髓損傷模型的建立：大鼠行0.3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔麻醉后固定于立體定向儀上，手

6、術(shù)暴露T11、T12、L1椎板，咬除椎板，盡量不損傷脊髓，然后縫合傷口，正常飼養(yǎng)2天。有后肢神經(jīng)功能障礙者被剔除。2天后，再次麻醉后固定，打開原手術(shù)切口，暴露T12脊髓，用改良的Allen裝置造成T12脊髓打擊傷，致傷力為7.5g×10cm，造成大鼠脊髓中度損傷?？p合傷口。動(dòng)物溫室隔離喂養(yǎng)。3、動(dòng)物處死方法和標(biāo)本制作；按需要在不同時(shí)期，用1％苯巴比妥50mg/kg快速推注處死動(dòng)物，小心取出損傷節(jié)段脊髓，取一半快速放入4％多聚甲醛(4℃)

7、液中固定12小時(shí)，以備石蠟切片后行病理檢查。另一半快速放入液氮中2分鐘后-80℃冰箱凍存。3、神經(jīng)功能評(píng)定：于處死前測(cè)定每組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能。神經(jīng)功能評(píng)定采用TARLOV(0-5)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。(0：雙后肢癱瘓1：后肢對(duì)剌激有反應(yīng)，但無自主運(yùn)動(dòng)2：有自主運(yùn)動(dòng)，不能站立3：能站立，但不能行走4：能行走，可有痙攣5：能行走，且能平衡。)評(píng)定前排空膀胱。4、病理學(xué)評(píng)定：將固定后的標(biāo)本連續(xù)切片(厚10μm)，行Nissl氏染色，經(jīng)華東理工大學(xué)自動(dòng)化

8、所細(xì)胞圖象分析系統(tǒng)Version2.0處理，計(jì)算脊髓斷面的總面積和損傷面積。5：PARP活性檢測(cè)：將冰存的脊髓組織標(biāo)本在冰浴PBS液中粉碎勻漿，加入5倍體積的冷PBS液懸浮，2000r/min4℃離心5分鐘，沉淀加入A液(100mmolNacl10mmolTris-HclpH7.6lmmolEDTApH8.01ug/mlaprotinin100ug/ml苯甲磺胺氯化物)冰水浴10分鐘，4℃震蕩10秒鐘，14000r/min室溫下離心30

9、分鐘，蛋白樣品(30ug)通過12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，應(yīng)用PVDF膜在4℃、400mA下電泳2小時(shí)。放入含有0.05％Tween-20的T-TBS,5％無脂牛奶液中室溫下防置1小時(shí)，然后用T-TBS液沖洗。將膜與兔多克隆抗-PARP抗體在室溫下孵育2小時(shí)，沖洗3遍，用ABC試劑孵育30分鐘，放置于含有鎳、銨的DBA液中5分鐘。(參照Westernblot試劑盒說明進(jìn)行)。蛋白含量測(cè)定采用LOWRY法。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)

10、據(jù)以-x±s表示，病理評(píng)分用T檢驗(yàn)，TARLOV評(píng)分及PARP活性表達(dá)在各組之間的差異采用方差分析。 結(jié)果：3-氨基苯甲酰胺(3-AB)治療組結(jié)果與對(duì)照組有顯著差異。(1)后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，治療C組明顯高于對(duì)照B組，但低于對(duì)照A組，治療D、E組與B組差異不大。(2)病理檢查可發(fā)現(xiàn)治療C組的損傷面積明顯減小，以C1、C2組明顯。(3)PARP表達(dá)在治療C組中被部分抑制，C2組最明顯。 結(jié)論：小劑量3-氨基苯甲酰胺對(duì)脊髓損傷