東北鶴虱多糖的提取純化及免疫活性初探.pdf

1、目的：本次研究的主要目的是提取、分離、純化東北鶴虱的多糖成分，進(jìn)而研究其部分性質(zhì)、多糖含量及單糖組成，并對其免疫活性進(jìn)行初步研究。 方法：1.采用水提醇沉法提取東北鶴虱粗多糖，醇沉物經(jīng)過無水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌，室溫減壓干燥，得疏松的東北鶴虱粗多糖(LEGCPS)粉末。2.LEGCPS的分離純化LEGCPS經(jīng)過5％三氯乙酸結(jié)合Sevag法去除游離蛋白后得東北鶴虱多糖(LEGPS)，在此基礎(chǔ)上，選取DEAE-SepharoseFas

2、tFlow凝膠為介質(zhì)，利用離子交換法對LEGPS進(jìn)行分離純化，依次用Tris-HCl溶液、0.2MNaCI溶液、0.5MNaCl溶液、1MNaCl溶液進(jìn)行洗脫。采用硫酸-蒽酮法檢測洗脫液的A625，繪制洗脫曲線，合并主峰，凍干。采用SephacrylS-200凝膠作為介質(zhì)，利用凝膠層析法，進(jìn)一步分離DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析柱中洗脫組份，以雙蒸水洗脫，采用硫酸-蒽酮法檢測洗脫液的A625，繪制洗脫曲線，合

3、并主峰，凍干，即得。3.利用斐林試劑反應(yīng)、淀粉實(shí)驗(yàn)、雙縮脲實(shí)驗(yàn)、茚三酮實(shí)驗(yàn)化學(xué)方法、紫外光譜分析及薄層色譜等方法對產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，采用蒽酮硫酸比色法對產(chǎn)物進(jìn)行多糖定量分析，采用考馬斯亮藍(lán)染色法對中間產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)定量跟蹤。4.通過噻唑藍(lán)比色法(MTT)觀察東北鶴虱多糖在體外對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的直接促進(jìn)作用，及對有絲分裂原刀豆蛋白ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的協(xié)同作用，以初步證明其免疫活性。 結(jié)果：1.LEGCPS為棕黃色

4、粉末，收率為4.68％。2.LEGCPS經(jīng)脫蛋白、透析后所得LEGPS，為淺棕色粉末，收率為21％，經(jīng)DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析柱后，依據(jù)出峰順序?qū)⑵浞謩e定義為LEGPS-I、LEGPS-II、L,EGPS-III、LEGPS-IV，LEGPS-II為主要洗脫峰，淺黃色粉末，收率為32.63％，說明LEGPS主要集中在0.2MNaCl洗脫組份上。LEGPS-II經(jīng)SephacrylS-200凝膠柱層析后，

5、依據(jù)出峰順序?qū)⑵浞謩e定義為LEGPS-II-A、LEGPS-II-B，均為白色粉末。LEGPS-II-A為主要洗脫峰，收率為32.63％，故僅對LEGPS-II-A進(jìn)行了相關(guān)的定性、定量及免疫活性探索。3.LEGPS-II-A經(jīng)多種方法定性分析，確定其不是多肽和蛋白質(zhì)，不含或含極低量氨基酸、蛋白質(zhì)的非淀粉類多糖，LEGPS-II-A經(jīng)蒽酮硫酸比色法測定，多糖含量達(dá)57％，該多糖為雜多糖，由葡萄糖，木糖，阿拉伯糖三種單糖組成。4.LEG-

6、CPS在0.04～5mg/ml濃度范圍內(nèi)，LEGPS在0.1～5mg/ml濃度范圍內(nèi)，均對ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)有顯著協(xié)同作用，并且作用隨劑量增大而增強(qiáng)。LEGPS-II-A在0.01～0.2mg/ml濃度范圍內(nèi)均具有明顯的直接促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的作用，并且作用隨劑量增大而增強(qiáng)，但未見對ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖有明顯作用。 結(jié)論：本次研究確定了東北鶴虱多糖的提取、分離路線和純化方法，得到PEGPS-II-A，為不含或