PEG交聯(lián)去細胞瓣多信號復合材料生物學性能研究.pdf

1、第一部分:PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料構(gòu)建及其體外生物相容性
　　 目的：PEG 交聯(lián)去細胞瓣構(gòu)建復合材料，并評價其體外生物相容性。
　　 方法：（1）合成功能團為丙烯?；闹癄頟EG，同時在去細胞瓣上引入巰基，通過丙烯酰基與巰基發(fā)生邁克爾加成反應，構(gòu)建PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料。（2）生物力學測試評價PEG 交聯(lián)對去細胞瓣機械性能的影響； CCK-8 法檢測復合材料浸提液對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖率影響，以評價其生物相

2、容性。
　　 結(jié)果：復合材料構(gòu)建條件溫和、效果確切；復合材料抗拉強度明顯高于去細胞瓣，且與天然瓣膜抗拉強度相比，差異無統(tǒng)計學差異。復合材料與去細胞瓣毒性評級均為0 級，與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義；人臍靜脈內(nèi)皮細胞在含復合材料浸提液的培養(yǎng)液中形態(tài)良好，增殖旺盛。
　　 結(jié)論：PEG 交聯(lián)去細胞瓣的方法能夠構(gòu)建與天然瓣膜相似抗拉強度且無細胞毒性的復合材料。
　　 第二部分：PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號復合材料構(gòu)

3、建
　　 第一節(jié)：構(gòu)建RGD-復合材料
　　 目的：評價PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料結(jié)合粘附肽（精-甘-天冬氨酸RGD 肽）的可行性和有效性。
　　 方法：復合材料與1ml 不同濃度（1.5mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml）GRGDSPC肽溶液在37℃反應，在不同時間點（1h，2h，4h），用分光光度法檢測復合材料結(jié)合GRGDSPC 肽質(zhì)量，并行免疫熒光定性檢測，去細胞瓣作為陰性對照

4、。
　　 結(jié)果：GRGDSPC 肽能有效地結(jié)合于復合材料，且一片復合材料與1ml GRGDSPC 肽（1mg/ml）在37℃條件下反應2h，結(jié)合GRGDSPC 肽質(zhì)量最大為（0.79±0.01）mg。
　　 結(jié)論：PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料，能夠在體外有效地結(jié)合RGD 肽，構(gòu)建RGD-復合材料。
　　 第二節(jié)：構(gòu)建VEGF-復合材料
　　 目的：評價PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料結(jié)合血管內(nèi)皮細胞生長因子（

5、VEGF）的可行性和有效性。
　　 方法：復合材料與1ml 不同濃度（500pg/ml，1000pg/ml，2000pg/ml）VEGF 溶液在37℃反應，在不同時間點（1h，2h，4h，12h），用ELISA 法檢測復合材料結(jié)合VEGF 質(zhì)量，并行免疫熒光檢測，去細胞瓣作為陰性對照。
　　 結(jié)果：VEGF 能有效地結(jié)合于復合材料，且一片復合材料與1ml VEGF（1000pg/ml）在37℃反應4h，其結(jié)合VEGF 質(zhì)

6、量最大為（896.87±3.27）pg。
　　 結(jié)論：PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料，能夠在體外有效地結(jié)合VEGF，構(gòu)建VEGF-復合材料。
　　 第三節(jié)：構(gòu)建PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號復合材料
　　 目的：評價PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料同時結(jié)合RGD 肽和VEGF的可行性和有效性。
　　 方法：復合材料與1ml 反應液（包含1mg/mlGRGDSPC 肽和1000pg/mlVEGF）在37℃
　　

7、 反應4h，對反應后復合材料行免疫熒光檢測，去細胞瓣作為陰性對照。
　　 結(jié)果：GRGDSPC 肽和VEGF 能同時有效地結(jié)合于復合材料。
　　 結(jié)論：PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料，能夠在體外有效地結(jié)合RGD 肽和VEGF，構(gòu)建PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號（RGD、VEGF）復合材料。
　　 第三部分：PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號復合材料生物學性能研究
　　 第一節(jié)：內(nèi)皮祖細胞分離、培養(yǎng)與鑒定目的：分離、培

8、養(yǎng)、鑒定臍帶血內(nèi)皮祖細胞，為其作為組織工程種子細胞提供實驗依據(jù)。
　　 方法：密度梯度離心法分離新鮮臍血中單個核細胞，在含堿性成纖維細胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過形態(tài)學、免疫熒光和流式細胞儀等對貼壁細胞進行鑒定；并與臍靜脈內(nèi)皮細胞進行增殖和遷移能力比較。
　　 結(jié)果：隨培養(yǎng)時間延長，貼壁細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，從小圓變成梭形，逐漸形成特征性克隆和典型成熟內(nèi)皮細胞鵝卵石樣形態(tài)；體外培養(yǎng)7天后，90％以上貼壁

9、細胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I 雙染陽性；貼壁細胞流式細胞儀分析顯示：培養(yǎng)7 d的細胞VEGFR-2、CD34和CD133表達分別占(77.35±4.86)％、(52.42±6.64)％和(19.36±2.14)％，培養(yǎng)28天的細胞VEGFR-2和CD34表達分別占(81.06±7.31)％和(7.62±3.14)％，而未檢測到CD133表達；人內(nèi)皮祖細胞增殖和遷移能力明顯高于人臍靜脈內(nèi)皮細胞。
　　 結(jié)論：用

10、密度梯度離心法和貼壁篩選法，可成功分離出臍帶血內(nèi)皮祖細胞，該方法簡單、經(jīng)濟、可行；且內(nèi)皮祖細胞可向內(nèi)皮細胞分化，增殖和遷移能力強，有望成為理想種子細胞。
　　 第二節(jié)：PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號復合材料生物學性能測定
　　 目的：研究PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號（RGD、VEGF）復合材料對內(nèi)皮祖細胞粘附和增殖的影響，為進一步構(gòu)建TEHV 提供依據(jù)。
　　 方法：A組去細胞瓣，B組PEG 交聯(lián)去細胞瓣復合材料，C組

11、VEGF-復合材料，D組為RGD-復合材料，E組PEG 交聯(lián)去細胞瓣多信號（RGD、VEGF）復合材料。然后在各組材料上種植EPCs，分別在種植后2h、4h、8h 用細胞計數(shù)和3H-TdR 摻入法檢測各組材料上細胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)，反映EPCs在各組材料上粘附性；分別在種植后2d、4d、8d，用細胞計數(shù)和3H-TdR 摻入法檢測各組瓣膜支架上細胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)，反映各組材料上EPCs 增殖情況。在種植8d 時，取各組瓣膜支架行蘇木素-

12、伊紅染色和掃描電鏡，以檢測EPCs在各組材料上生長情況，并取E組支架材料上細胞行RT-PCR檢測t-PA和eNOS的表達，以評價新內(nèi)皮抗血栓形成功能。
　　 結(jié)果：（1）種植后2h、4h、8h 時各組細胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)為：D組＞E組＞C組＞A組＞B組，其中A組與B組之間各個時間點均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）,8h時D組與E組之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余時間點各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（2）

13、種植2d、4d、8d 時各組細胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)為：A組均大于B組（P＞0.05），C組、D組和E組均大于同一時間點A組和B組（P＜0.05）；種植2d 時，E組＞C組（P＜0.05），D組＞E組（P＞0.05）；種植4d 時，E組＞D組（P＜0.05），D組＞C組（P＜0.05）；種植8d 時，E組＞D組（P＜0.05），D組＞C組（P＞0.05）。（3）蘇木素-伊紅染色和掃描電鏡檢測顯示：種植8d后，與其它組相比，E組瓣膜支架上可見