金屬硫蛋白對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷時(shí)相關(guān)凋亡基因Caspase-3表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：在建立大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷模型的基礎(chǔ)上，采用半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction， RT-PCR)、免疫組織化學(xué)法，并應(yīng)用外源性葡萄糖酸鋅誘導(dǎo)體內(nèi)MT生成，觀察大鼠皮瓣缺血再灌注組織中不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡及Caspase-3基因和蛋白的表達(dá)，探討MT對(duì)缺血再灌注損傷相關(guān)基因Caspase-3表達(dá)的影響，從基因水平闡明MT對(duì)缺血再灌注損傷皮瓣的

2、保護(hù)作用機(jī)理，對(duì)為防治各種組織瓣移植中出現(xiàn)的缺血再灌注損傷，提高組織瓣移植成活率的臨床研究，提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性健康清潔級(jí)Wistar大鼠120只，稱重，編號(hào)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：把120只大鼠隨機(jī)分為三組：(1)實(shí)驗(yàn)A組（缺血再灌注組）(2)實(shí)驗(yàn)B組（給藥組）(3)對(duì)照組，每組40只，各組按5個(gè)時(shí)間點(diǎn)再分為5組，每組8只大鼠。
　　 3.皮瓣制備方法：2

3、％戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，每3小時(shí)追加一次(20mg/kg)以維持麻醉，大鼠仰臥，四肢固定，剪除腹毛，75％酒精消毒，按照Petry JJ等描述的方法，于右下腹設(shè)計(jì)一以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣，大小為6cm×3cm。對(duì)照組在皮瓣形成后原位縫合，不做其他處理；實(shí)驗(yàn)A組在皮瓣形成后，用微血管夾夾閉腹壁淺動(dòng)脈發(fā)出點(diǎn)近端的股動(dòng)脈，在手術(shù)顯微鏡下確認(rèn)股動(dòng)脈和腹壁淺動(dòng)脈被完全阻斷，皮瓣原位縫合，8小時(shí)后再次手術(shù)去除血管夾；實(shí)驗(yàn)B組

4、于術(shù)前24小時(shí)，向大鼠管飼葡萄糖酸鋅140mg/Kg，其余操作同實(shí)驗(yàn)A組。
　　 4.取材：實(shí)驗(yàn)A組和B組的40只大鼠于掀起皮瓣后即刻、再灌注后1小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)分別于皮瓣中段邊緣取全層皮瓣組織1cm×0.5cm，對(duì)照組分別于掀起皮瓣即刻、術(shù)后9小時(shí)、14小時(shí)、20小時(shí)和32小時(shí)取材。所取組織一半用4％多聚甲醛固定，行免疫組化檢測(cè)；另一半超低溫冰凍保存，制作單細(xì)胞懸液，以備Caspase-3 mRNA檢測(cè)。

5、>　　 5.檢測(cè)方法及指標(biāo)：(1) HE染色切片，光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿呈粉紅色，肌纖維及膠原纖維呈紅色。(2)免疫組化檢測(cè)及評(píng)分：對(duì)石蠟切片進(jìn)行SP法免疫組化染色，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，光鏡下觀察Caspase-3蛋白的分布和著色深淺程度，陽性與陰性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行，陽性信號(hào)以胞質(zhì)或胞膜有棕黃色或棕褐色顆粒為判定標(biāo)準(zhǔn)。免疫組化評(píng)分(immunohistochemical scores，IHS)方法參照文獻(xiàn)，

6、結(jié)合陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個(gè)方面評(píng)分：a為陽性細(xì)胞百分比(無陽性細(xì)胞=0，陽性細(xì)胞占1-10％=1，11-50％=2，51-80％=3，81-100％=4)，b為陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱（陰性=0，弱陽性=1，中度陽性=2，強(qiáng)陽性=3），a，b兩項(xiàng)乘積即為該例組織的IHS。(3)逆轉(zhuǎn)錄，多聚酶鏈反應(yīng)法（reverse transcription，RT-PCR）半定量檢測(cè)Caspase-3 mRNA水平：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)引物序列，由北

7、京塞百盛基因技術(shù)有限公司合成。引物序列：Caspase-3上游引物：5｀- AAGCCGAAACTCTTCATC-3｀，Caspase-3下游引物：5｀- TGAGCATTGACACAATACAC-3｀。β-actin上游引物：5｀- TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG-3｀，β-actin下游引物：5｀- GGAACCGCTCATTGCCGATAGT-3｀。按Trizol RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，RNA保

8、存在-80℃，用紫外分光光度吸收法測(cè)定RNA的含量。然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，取每個(gè)標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)作為標(biāo)準(zhǔn)片段標(biāo)記，電泳后以紫外透射儀觀察，并用數(shù)碼相機(jī)照相，輸入微機(jī)應(yīng)用凝膠圖象分析系統(tǒng)對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行分析，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結(jié)果以兩者之積分吸光度的比值表示。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件，對(duì)不同類型數(shù)據(jù)進(jìn)行不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。<

9、br>　　 結(jié)果：
　　 1.皮瓣缺血再灌注時(shí)的組織病理學(xué)變化：缺血再灌注后，實(shí)驗(yàn)A組可見大多數(shù)細(xì)胞胞體縮小，核固縮，胞質(zhì)嗜酸性深染，這種變化在再灌注后24小時(shí)尤為明顯。對(duì)照組的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)基本正常，無上述變化。而實(shí)驗(yàn)B組異常細(xì)胞均較實(shí)驗(yàn)A組顯著減少，且受損程度較輕，多表現(xiàn)為細(xì)胞胞漿輕度深染，核固縮，仁消失者也少見。
　　 2.免疫組化染色結(jié)果：染色主要位于胞漿，呈棕黃色或棕褐色。光鏡下觀察，Caspase-3陽性細(xì)

10、胞主要在皮瓣組織的上皮基底細(xì)胞層、成纖維細(xì)胞、毛囊、汗腺、皮脂腺及血管內(nèi)皮細(xì)胞中，和凋亡細(xì)胞的分布區(qū)域基本相同。對(duì)照組可見少量、散在分布的Caspase-3陽性細(xì)胞，面積小，染色淺，表達(dá)微弱；實(shí)驗(yàn)A組Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)隨缺血再灌注時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，并在缺血再灌注24小時(shí)后達(dá)高峰?？梢娺B成線片狀，染色最深，表達(dá)最強(qiáng)；而實(shí)驗(yàn)B組則較A組表達(dá)明顯減弱。正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)A組和實(shí)驗(yàn)B組表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免

11、疫組化染色評(píng)分：結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)A組的陽性細(xì)胞表達(dá)隨時(shí)間增長(zhǎng)逐級(jí)增強(qiáng)，與對(duì)照組相比有顯著差異(P＜0.01)，再灌注后24小時(shí)達(dá)高峰。實(shí)驗(yàn)B組雖然也逐漸增強(qiáng)，但是相鄰時(shí)間點(diǎn)之間并無顯著差異(P＞0，05)。但實(shí)驗(yàn) A組和實(shí)驗(yàn)B組之間陽性細(xì)胞表達(dá)差異明顯(P＜0.01)，說明應(yīng)用葡萄糖酸鋅后產(chǎn)生的金屬硫蛋白對(duì)Caspase-3活性表達(dá)有一定抑制作用。
　　 3.RT-PCR法測(cè)Caspase-3 mRNA水平：根據(jù)PCR-Marke

12、r所示，RT-PCR結(jié)果顯示所擴(kuò)增的Caspase-3基因片段大小約為349 bp，內(nèi)參B-Actin基因片段大小約576 bp，與目標(biāo)片段大小一致，提示均為特異性擴(kuò)增。對(duì)照組 Caspase-3 mRNA有少量表達(dá)。實(shí)驗(yàn)A組在掀起皮瓣即刻、缺血再灌注1 h和再灌流6h后，Caspase-3 mRNA表達(dá)明顯增加，以后隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，至再灌注24h達(dá)高峰，以后增幅逐級(jí)減小(相鄰時(shí)間點(diǎn)比較P＜0.05)。在實(shí)驗(yàn)B組中，

13、隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，Caspase-3 mRNA表達(dá)活性雖然也在增加，但是與實(shí)驗(yàn)A組相比其增幅顯著降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.皮瓣缺血再灌注后，其組織內(nèi)出現(xiàn)Caspase-3活性增高，提示 Caspase-3參與了皮瓣組織缺血再灌注時(shí)細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程。
　　 2.應(yīng)用葡萄糖酸鋅后，皮瓣缺血再灌注后Caspase-3的表達(dá)活性有所下降，進(jìn)一步證實(shí)Caspase-3確實(shí)參與了皮瓣組織細(xì)胞凋亡過程