調(diào)控Smad3表達(dá)對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞ECM代謝的影響.pdf

1、目前體內(nèi)、外研究表明，TGF—β1/Smad信號(hào)通路在腎小球硬化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。TGF-B1促纖維化的作用大部分都是通過(guò)Smad3介導(dǎo)的，Smad3丟失后能阻止TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和膠原、PAI-1、TIMP-1基因的表達(dá)，Smad3敲除的小鼠對(duì)各種實(shí)驗(yàn)性器官纖維化模型(如放射線誘發(fā)的皮膚纖維化，博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化和鏈唑霉素誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病的腎小球硬化)都有抵抗效果；在EMT導(dǎo)致的纖維化改變中(如增

2、殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變，角膜損傷，單側(cè)輸尿管阻塞的動(dòng)物模型)，Smad3缺失的小鼠的纖維化反應(yīng)隨之消失。若采用各種方法上調(diào)Smad7的表達(dá)，或者使用小分子物質(zhì)halofuginone抑制Smad3，均能顯著減輕各種器官纖維化動(dòng)物模型的纖維化程度。 近年來(lái)還報(bào)道IFN-γ具有抗纖維化功能，在肝、腎纖維化動(dòng)物模型中，均證明IFN-γ具有顯著抑制ECM合成的作用。實(shí)驗(yàn)表明，IFN-γ下游的Jak/Stat和CKII/YB-1信號(hào)通路均參

3、與這種作用，還證明與TGF-β1/Smad信號(hào)通路存在串話(cross-talk)。 本課題擬采用細(xì)胞轉(zhuǎn)基因及RNA干擾技術(shù)，觀察增強(qiáng)或降低Smad3的表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠腎MsC ECM組分、基質(zhì)金屬降解酶及其抑制劑系統(tǒng)表達(dá)的影響；探討Smad3在γ-IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用，為進(jìn)一步闡明TGF-β1/Smad信號(hào)通路在。腎小球硬化發(fā)生中的作用，及γ-干擾素對(duì)腎小球疾病的防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4、 第一部分 Smad3基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞ECM代謝的影響 目的： 通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Smad3的MsC克??；觀察Smad3過(guò)表達(dá)對(duì)MsC CollV、FN和MMP-2/TIMP-2表達(dá)的影響；觀察Smad3對(duì)FN啟動(dòng)子活性的影響。 方法： 構(gòu)建pIRES2-EGFP-Smad3真核表達(dá)質(zhì)粒；采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，G418篩選，將Smad3基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的MsC，并作鑒定

5、；分別用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、Western blot法，觀察在TGFβ1作用下，轉(zhuǎn)基因MsC ColIV、FN和MMP-2/TIMP-2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的改變。將含F(xiàn)N啟動(dòng)子的pGL2F1900質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MsC，通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性以顯示啟動(dòng)子的活性。 結(jié)果： 成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-Smad3真核表達(dá)質(zhì)粒，獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Smad3的MsC克?。籘GFβ1可顯著促進(jìn)其ECM合成，表現(xiàn)為ColIV、FN mR

6、NA分別升高2.5倍和1.3倍(P＜<0.05)，蛋白水平分別升高3.1倍和1.5倍(P＜0.05)；TGFβ1可明顯上調(diào)MMP-2、TIMP-2的表達(dá)，基因轉(zhuǎn)錄分別升高1.8倍和2.5倍(P＜0.05)，蛋白表達(dá)分別升高2.1倍和3倍(P＜0.05)。Smad3穩(wěn)定表達(dá)的MsC細(xì)胞，F(xiàn)luc相對(duì)活性是空白細(xì)胞株的2-3倍；RNA干擾抑制Smad3后，F(xiàn)lue相對(duì)活性與空白細(xì)胞對(duì)照則無(wú)差異。 小結(jié)： 構(gòu)建pIRES2-E

7、GFP-Smad3真核表達(dá)質(zhì)粒，建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Smad3的MsC克隆；Smad3基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)后，TGF-β1促進(jìn)MsC ECM成分合成的作用明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為ColIV、FN蛋白水平明顯升高：同時(shí)，TGF-β1上調(diào)MsCMMP-2、TIMP-2表達(dá)均明顯增強(qiáng)。Smad3過(guò)表達(dá)能提高FN啟動(dòng)子的活性。 第二部分 RNA干擾Smad3基因表達(dá)對(duì)大鼠腎MsC ECM代謝的影響 目的： 構(gòu)建Smad3干擾質(zhì)粒；探討Sma

8、d3經(jīng)RNA干擾后對(duì)大鼠腎MsCColIV、FN和MMP-2/TIMP-2表達(dá)的影響。 方法： 構(gòu)建Smad3干擾質(zhì)粒；將質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的MsC，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western blot檢測(cè)Smad3干擾的效果，篩選有效干擾質(zhì)粒；采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Westem blot檢測(cè)Smad3干擾后ColIV、FN和MMP-2/TIMP-2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果； 經(jīng)RNA

9、干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的MsC，其Smad3 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯下降；Smad3干擾后TGF-β1作用下MsC ColIV、FN和MMP-2/TIMP-2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)均明顯下降(mRNA水平分別下降44％、54％、47％、53％，蛋白水平分別下降32％、45％、52％、47％)(P＜0.05)。 小結(jié)： 獲得有效減低Smad3表達(dá)的干擾質(zhì)粒;Smad3干擾能降低ColIV、FN和MMp.2/TIMp.2基因轉(zhuǎn)錄及蛋

10、白表達(dá)。 第三部分γ-干擾素對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞TGFβ/Smad信號(hào)通路和ECM代謝的影響 目的： 用IFN-γ處理培養(yǎng)的MsC，觀察其增殖、TGF-β1/Smad信號(hào)通路和MMP-2/TIMP-2基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的變化，探討IFN-γ減輕腎小球硬化的可能作用機(jī)制。 方法： 用不同濃度的IFN-γ刺激MsC，MTT法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響；100IU/mL IFN-γ作用于MsC后，在不同時(shí)間(0

11、h、0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、24h)收集細(xì)胞，分別應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、Westem blot檢測(cè)其TGF-β1/Smad信號(hào)通路(Smad3、Smad7)、MMP-2/TIMP-2轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： 經(jīng)IFN-γ處理的MsC，其增殖不受影響；Smad7的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)在IFN-γ作用0.5h后立即升高，僅維持在6h內(nèi)，而Smad3的升高則在作用6h之后；MMP-2的基因轉(zhuǎn)錄及蛋

12、白表達(dá)在作用6h時(shí)升高，而TIMP-2在6h時(shí)則降低。 小結(jié)： IFN-γ可能通過(guò)影響MsC的TGF-β1/Smad信號(hào)通路，增強(qiáng)MMP-2和降低TIMP-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而起到減輕腎組織纖維化的作用。 結(jié)論： 1.成功建立過(guò)表達(dá)Smad3的陽(yáng)性MsC克隆。Smad3過(guò)表達(dá)后，TGF-β1可顯著促進(jìn)ECM成分(ColIV、FN)合成，同時(shí)，TGF-β1可明顯上調(diào)MMP-2、TIMP-2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白分泌。

13、 2.獲得能有效降低Smad3表達(dá)的siRNA載體。Smad3 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能降低MSC ColIV、FN、MMP-2、TIMP-2 mRNA及蛋白水平。 3.Smad3可能通過(guò)提高FN啟動(dòng)子的活性而增強(qiáng)FN的表達(dá)。 4.IFN-γ可能通過(guò)影響MsC的TGF-β1/Smad信號(hào)通路，增強(qiáng)MMP-2和降低TIMP-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而起到減輕腎組織纖維化的作用。因此，Smad與IFN-γ信號(hào)通路可能存在cross-