慢性痛大鼠海馬NO-cGMP-PKG信號(hào)通路在針刺累積鎮(zhèn)痛效應(yīng)中的作用分析.pdf

1、研究背景:
　　 自從美國國家衛(wèi)生研究所(NIH)將針灸確立為補(bǔ)充醫(yī)學(xué)后，針刺引起的鎮(zhèn)痛效應(yīng)已被廣泛的應(yīng)用于減輕患者的各種疼痛，尤其是慢性疼痛。大量研究結(jié)果表明:針刺鎮(zhèn)痛的過程涉及到中樞神經(jīng)系統(tǒng)各級(jí)水平的整合和調(diào)節(jié)過程。針刺信號(hào)主要通過脊髓腹外側(cè)索上傳入腦，腦的許多核團(tuán)共同構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參與針刺鎮(zhèn)痛，包括導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、中縫大核、藍(lán)斑、下丘腦弓狀核、韁核、伏隔核、杏仁核、尾狀核、大腦皮層等，但是海馬在針刺鎮(zhèn)痛中的作用的研究報(bào)

2、道還相對(duì)較少。我們前期在在結(jié)扎坐骨神經(jīng)造成的慢性神經(jīng)痛(CCI)大鼠上的研究結(jié)果表明:重復(fù)電針刺激足三里-陽陵泉具有累積性鎮(zhèn)痛效應(yīng)，該累積效應(yīng)與其1)上調(diào)海馬CA3、CA1區(qū)神經(jīng)末梢突觸素(SYN)及鈣調(diào)蛋白激酶(CaMKII)及蛋白激酶A(PKA)蛋白的表達(dá);2）改善CCI引起的海馬CA3區(qū)神經(jīng)元突觸間隙增寬、突觸后致密層(PSD)厚度變薄等等異常變化，良性調(diào)節(jié)突觸的可塑性緊密相關(guān)。
　　 神經(jīng)損傷造成的慢性神經(jīng)痛和炎性疼痛可

3、導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的變化。業(yè)已證明:在疼痛條件下，海馬也發(fā)生了形態(tài)學(xué)、神經(jīng)元突觸的可塑性、和相關(guān)的基因及蛋白表達(dá)的變化。一氧化氮(NO)是細(xì)胞內(nèi)的逆行信使，參與多種生理學(xué)的過程，包括外周及中樞水平的痛覺調(diào)制，突觸的可塑性，海馬長時(shí)程增強(qiáng)(LTP，即突觸傳遞效應(yīng)的增加)以及學(xué)習(xí)記憶。NO引起的cGMP的生成也參與海馬LTP。在脊髓水平，NO參與痛覺過敏的形成和發(fā)展，其效應(yīng)可能是綜合效應(yīng)的結(jié)果，既涉及cGMP水平的調(diào)節(jié)，又包含Ca2+協(xié)

4、同作用，以及一些尚未闡明的機(jī)制。在細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)流的Ca2+與鈣調(diào)蛋白(CaM)偶聯(lián)，共同作用于NOS，以分子氧和L-精氨酸(L-Arg)為底物，產(chǎn)生NO。NO就通過擴(kuò)散而作用于鄰近細(xì)胞，或者直接作用于其所在細(xì)胞，結(jié)合到胞漿可溶型鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)血紅素模體上，使酶發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)而被激活，進(jìn)而把GTP轉(zhuǎn)化為cGMP，從而增加cGMP，進(jìn)一步激活cGMP依賴的蛋白激酶G(PKG)，從而使脊髓背角傷害感受性神經(jīng)元興奮，把傷害性信息進(jìn)一步傳向腦

5、高位中樞，即脊髓水平的NO通過NO-cGMP-PKG信號(hào)通路參與傷害性信息的傳遞過程[55-57]。但是海馬NO-cGMP-PKG信號(hào)通路是否參與慢性神經(jīng)病理性疼痛還未見有報(bào)道。
　　 因此，本實(shí)驗(yàn)在大鼠CCI模型上，探討電針雙側(cè)足三里、陽陵泉穴對(duì)動(dòng)物疼痛反應(yīng)的影響及海馬NO-cGMP-PKG信號(hào)通路nNOS、cGMP、PKG的表達(dá)變化，進(jìn)一步研究電針緩解慢性神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制，從更深的層次上闡明針刺累積效應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制和

6、科學(xué)內(nèi)涵。為臨床針刺治療慢性痛、進(jìn)一步推廣針灸療法提供科學(xué)依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 第一部分實(shí)驗(yàn):取健康雄性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為正常對(duì)照(NOR)組(n=8)、模型(CCI)組(n=8)、EA-2Hz組(電針2Hz)(n=8)、EA-2/15Hz(電針2/15Hz)組(n=8)、EA-100Hz（電針100Hz）電針組(n=8)。結(jié)扎坐骨神經(jīng)造成CCI慢性痛模型。電針雙側(cè)“足三里”-“陽陵泉”穴(2H

7、z，2/15Hz，100Hz，1mA，1次/D)。用輻射熱照射和VON FREY刺激大鼠雙側(cè)足底，引起的縮腿反應(yīng)潛伏期(PWL)的差值作為痛敏分?jǐn)?shù)(HS)判斷動(dòng)物的痛反應(yīng)。在麻醉狀態(tài)下，取動(dòng)物海馬組織予以勻漿后，用RT-PCR的方法來檢測(cè)nNOS，iNOS，PKG mRNA的表達(dá)的變化。以選擇較佳的電針參數(shù)。
　　 第二部分實(shí)驗(yàn):取健康雄性Wistar大鼠56只，隨機(jī)分為正常對(duì)照(NOR)組(n=8)、模型(CCI)組(n=8)

8、、EA-2/15Hz組(n=8)、EA+7-NI（nNOS抑制劑）組(n=8)、EA+DMSO（nNOS抑制劑溶劑）組(n=8)、EA+LY83583（sGC抑制劑溶劑）組(n=8)、EA+Ethanol（sGC抑制劑溶劑溶劑）組(n=8)。電針前后四組給予海馬CA1區(qū)（AP-3.72mm，R/L2.2mm，H2.4 mm）微量注射nNOS抑制劑7-NI(15mg/ml)、sGC抑制劑LY83583(3mg/ml)，0.5μl/次，隔天

9、1次。然后電針雙側(cè)“足三里”-“陽陵泉”穴（2/15Hz，1mA，1次/D），微量注射隔每天1次。用輻射熱照射和VON FREY刺激大鼠雙側(cè)足底，引起的縮腿反應(yīng)潛伏期(PWL)的差值作為痛敏分?jǐn)?shù)(HS)判斷動(dòng)物的痛反應(yīng)。在麻醉狀態(tài)下，動(dòng)物取海馬組織勻漿后，用Western Blot的方法來檢測(cè)nNOS，sGC蛋白表達(dá)的變化。以驗(yàn)證nNOS，cGMP是否參與電針的效應(yīng)。
　　 結(jié)果:
　　 1)電針對(duì)CCI大鼠痛行為的影響

10、:
　　 與CCI術(shù)前（模型組0.35±0.05 sec,2Hz電針組0.47±0.12 sec,2/15Hz電針組0.37±0.08 sec，模型+100Hz組0.30±0.05 sec）比較，各組動(dòng)物的熱輻射躲避潛伏期（模型組6.82±0.35 sec,2Hz電針組7.07±0.53 sec,2/15Hz電針組6.28±1.11 sec，模型+100Hz組6.53±0.10 sec）明顯縮短，痛閾降低（P＜0.05）。與同時(shí)

11、期模型組比(EA3 d:6.78±0.47sec, EA7 d:6.02±0.75sec, EA10 d:3.92±0.29sec, EA14 d2.98±0.39sec),2Hz電針組(3.82±0.89sec,3.55±0.92sec,2.32±0.65sec,2.02±0.35sec)、2/15Hz電針組(3.65±0.75sec,3.05±0.98sec,2.03±0.46sec,1.88±0.31 sec)動(dòng)物的痛閾明顯升高，

12、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而100Hz電針組的痛閾值(4.72±1.20sec,4.40±1.24sec,3.38±0.73sec,2.13±0.38sec) EA3 d和EA14 d與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EA7 d，10 d則未見明顯變化(P＞0.05)。
　　 與CCI術(shù)前（模型組0.43±0.07 sec,2Hz電針組0.40±0.11 sec,2/15Hz電針組0.45±0.06 sec,100

13、Hz電針組0.47±0.15 sec）比較，各組動(dòng)物的機(jī)械痛敏分?jǐn)?shù)（模型組4.20±0.81 sec,2Hz電針組3.58±0.29 sec,2/15Hz電針組5.00±0.67 sec,100Hz電針組4.57±0.88 sec）明顯縮短，痛閾降低（P＜0.05）。與同時(shí)期模型組比(EA3 d:4.53±0.59sec, EA7 d:3.00±0.61sec, EA10 d:2.92±0.39sec, EA14 d:2.70±0.27

14、sec),2Hz電針組(2.27±0.46sec,2.12±0.37sec,2.47±0.36sec,1.50±0.18sec)、2/15Hz電針組(2.22±0.27sec,2.00±0.23sec,1.47±0.08sec,1.15±0.14sec)動(dòng)物的痛閾明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）;而100Hz電針組的痛閾值(2.50±0.34sec,2.38±0.28sec,2.52±0.22sec,1.13±0.26sec)

15、EA3 d和EA14 d與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EA7 d，10 d則未見明顯變化(P＞0.05)。
　　 2)電針對(duì)海馬NO/cGMP/PKG信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)mRNA相對(duì)表達(dá)量變化的影響。
　　 熒光定量Real Time-PCR結(jié)果顯示，CCI術(shù)后，與正常對(duì)照組比較(0.86±0.07)，模型組動(dòng)物海馬nNOS mRNA表達(dá)量(1.80±0.36)顯著增高（P＜0.05）。與模型組比較，2 Hz電針

16、組nNOS mRNA的表達(dá)量(1.16±0.09)顯著降低(P＜0.05);2/15 Hz電針組nNOS mRNA的表達(dá)量(1.20±0.07)顯著降低（P＜0.05);100 Hz電針組mRNA的表達(dá)量(1.00±0.17)顯著降低(P＜0.05)。
　　 CCI術(shù)后，與正常對(duì)照組比較(0.92±0.05)，模型組動(dòng)物海馬PKG mRNA表達(dá)量(1.13±0.11輕度增高(P＞0.05);與模型組比較，2 Hz電針組PKG m

17、RNA的表達(dá)量(0.81±0.09)顯著降低(P＜0.05);2/15 Hz電針組PKG mRNA的表達(dá)量(0.77±0.07)顯著降低(P＜0.05);100 Hz電針組mRNA的表達(dá)量(0.65±0.11)顯著降低(P＜0.05)。
　　 CCI術(shù)后，與正常對(duì)照組比較(0.62±0.11)，模型組動(dòng)物海馬iNOS mRNA表達(dá)量(0.62±0.05）沒有變化(P＞0.05);與模型組比較，2 Hz電針組PKG mRNA的表達(dá)

18、量(0.67±0.03)輕度升高(P＞0.05);2/15 Hz電針組PKG mRNA的表達(dá)量(0.50±0.02)、100Hz電針組mRNA的表達(dá)量(0.52±0.12)輕度降低(P＞0.05)。
　　 3)海馬內(nèi)注射NOS抑制劑驗(yàn)證NO在針刺累積性鎮(zhèn)痛效應(yīng)中的作用。
　　 與CCI術(shù)前（模型組0.54±0.13sec, EA-2/15Hz組0.23±0.09 sec, EA-NI組0.21±0.05 sec, EA-

19、LY83583組0.37±0.10 sec, EA-DMSO組0.51±0.13 sec,模型+ethanol組0.42±0.11 sec，）比較，各組動(dòng)物的熱輻射躲避潛伏期（模型組6.55±1.80sec, EA-2/15Hz組7.05±0.87 sec, EA-7-NI組6.16±1.76 sec,EA-LY83583組6.16±0.59 sec,EA-DMSO組6.58±0.80 sec, EA-ethanol組5.57±0.82

20、 sec,)明顯縮短，痛閾降低(P＜0.05)。與同時(shí)期模型組比(EA7 d:5.18±1.24sec, EA10 d:4.58±1.14sec, EA14 d4.58±0.68sec), EA-2/15Hz組(4.00±1.18 sec,2.92±0.51sec,2.00±0.48sec), EA-7-NI組(3.04±0.28sec,1.77±0.53sec,1.46±0.31 sec), EA-LY83583組(2.57±0.69

21、sec,1.56±0.21sec,0.94±0.18sec), EA-DMSO組(2.82±0.54sec,1.80±0.65sec,1.17±0.37sec), EA-ethanol組(3.52±0.91sec,2.19±0.61sec,1.83±0.63sec)動(dòng)物的痛閾明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 與CCI術(shù)前模型組0.43±0.07seC, EA-2/15Hz組0.45±0.11 sec, EA-7-

22、NI組0.40±0.06 sec, EA-LY83583組0.50±0.13 sec,EA-DMSO組0.47±0.15 sec,EA-ethanol組0.70±0.19 sec，）比較，各組動(dòng)物的VON FREY躲避潛伏期（模型組5.45±0.90sec, EA-2/15Hz組5.72±0.35sec,EA-7-NI組4.56±1.28 sec,EA-LY83583組4.93±0.61 sec,EA-DMSO組4.57±0.20 se

23、c,EA-ethanol組4.77±0.66 sec，)明顯縮短，痛閾降低(P＜0.05)。與同時(shí)期模型組比(EA7 d:4.10±1.42sec, EA10 d:4.25±1.60sec, EA14 d4.33±1.15 sec), EA-2/15Hz組(3.03±0.61 sec,2.58±0.85sec,2.53±0.89sec),EA-7-NI組(2.00±0.95sec,1.66±0.99sec,1.48±0.71 sec),

24、 EA-LY83583組(2.32±0.59sec,1.28±0.15sec,1.48±0.20sec),EA-DMS0組(2.33±0.26sec,2.51±0.58sec,1.93±0.34sec), EA-ethanol組(2.76±1.10sec,2.09±0.59sec,1.98±0.65sec)動(dòng)物的痛閾明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 Western Blot結(jié)果顯示，CCI術(shù)后，與正常對(duì)照組比較(

25、0.97±0.22)，模型組動(dòng)物海馬nNOS蛋白表達(dá)量(1.12±0.20)輕度增高(P＞0.05)。與模型組比較，2/15 Hz電針組nNOS mRNA的表達(dá)量(1.01±0.22)輕度降低(P＞0.05);模型+7-NI(nNOS抑制劑)組mRNA的表達(dá)量(1.02±0.23)輕度降低(P＞0.05)。
　　 CCI術(shù)后，與正常對(duì)照組比較(0.27±0.03)，模型組動(dòng)物海馬sGC蛋白表達(dá)量(0.37±0.04)輕度增高(P

26、＞0.05);與模型組比較，2/15電針Hz組sGC蛋白的表達(dá)量(0.25±0.10)明顯降低(P＞0.05);EA-LY83583組sGC蛋白表達(dá)量(0.35±0.05)輕度降低(P＞0.05)。
　　 小結(jié):
　　 1)大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(CCI)可引起的明顯的痛反應(yīng)，上調(diào)海馬nNOS，PKG mRNA及nNOS，sGC蛋白的表達(dá)，說明手術(shù)造成的組織損傷引起了疼痛反應(yīng)時(shí)，海馬組織rNOS，PKG，sGC活動(dòng)增

27、強(qiáng)。
　　 2)電針雙側(cè)“足三里”與“陽陵泉”穴均可緩解CCI引起的明顯的痛反應(yīng)，并且電針2/15Hz組產(chǎn)生的對(duì)痛敏的抑制效應(yīng)稍優(yōu)于電針2Hz組及100Hz組。
　　 3)電針雙側(cè)“足三里”或“陽陵泉”穴可顯著下調(diào)CCI引起的海馬內(nèi)增加的nNOS、PKG mRNA及輕微下調(diào)nNOS，sGC蛋白的表達(dá)，說明海馬內(nèi)nNOS，PKG，和sGC可能參與電針緩解CCI痛行為反應(yīng)。
　　 4)2 Hz、2/15Hz、100H