DMD病人特異性iPS細(xì)胞系的誘導(dǎo)及其打靶的初步研究.pdf

1、杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種致死性X連鎖隱性遺傳病，該疾病是由于DMD基因的突變造成Dystrophin蛋白的缺失或功能喪失所致，目前臨床上對該疾病尚無有效的治療手段，而基因治療的興起為DMD治療帶來了新的希望。本研究首先以逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)DMD患者皮膚成纖維細(xì)胞(HDFs)成為DMD病人特異性ips細(xì)胞（DFiPS），然后構(gòu)建新型非病毒核糖體區(qū)基因打靶載體pHr2-nl-CDysG，并對上述ips細(xì)胞進(jìn)行打靶的初步實(shí)驗(yàn)研究。為將Min

2、idystrophin基因定點(diǎn)整合至iPS細(xì)胞基因組中，篩選穩(wěn)定表達(dá)Minidystrophin蛋白的iPS細(xì)胞克隆奠定了基礎(chǔ)，也為采用ex vivo（間接體內(nèi)）途徑進(jìn)行DMD基因治療開辟一條新的思路。
　　第一部分:DMD患者皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)自體多潛能干細(xì)胞
　　目的:利用皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)建立DMD疾病特異型ips細(xì)胞系。
　　方法:利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將四種經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子Oct4，Sox2，c-Myc和K

3、lf4導(dǎo)入DMD患者皮膚成纖維細(xì)胞，并且在誘導(dǎo)過程中添加小分子Vc和VPA，最終獲得DMD患者來源的iPS細(xì)胞。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶染色、干細(xì)胞表面多潛能標(biāo)志物染色及細(xì)胞核型檢測對傳代后的克隆進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:(1)將包裝質(zhì)粒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過脂質(zhì)體 Lipofectamine2000共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，獲得優(yōu)質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄病毒;(2)誘導(dǎo)出細(xì)胞克隆形態(tài)上與iPS細(xì)胞相似，挑取上述克隆傳代，堿性磷酸酶染色呈陽性，iPS細(xì)

4、胞表面標(biāo)志免疫熒光檢測呈陽性。傳至P9代，仍然具有iPS樣克隆形態(tài)。(3)通過細(xì)胞染色體核型檢測顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞沒有發(fā)生染色體水平的突變。
　　結(jié)論:利用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)將DMD患者皮膚成纖維細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，通過細(xì)胞核型、表面標(biāo)志物及體外分化等鑒定DMD疾病特異型iPS細(xì)胞系的全能性。
　　第二部分:新型DMD基因治療載體的構(gòu)建及打靶探究
　　目的:構(gòu)建攜帶Minidystrophin治療基因的新型非病毒核糖體基因

5、區(qū)打靶載體，通過打靶將Minidystrophin基因定點(diǎn)整合至DFiPS細(xì)胞基因組中，篩選穩(wěn)定表達(dá)Minidystrophin蛋白的DFiPS細(xì)胞克隆。
　　方法:(1) pHr2-nl-CDysG打靶載體的構(gòu)建:首先用PCR克隆CAG啟動子和BGH PolyA，然后將其正向連入pGEM-T Easy載體當(dāng)中。從本室構(gòu)建的核糖體基因區(qū)打靶載體pHrneoDysG中酶切下DysG融合基因，連入CAG啟動子和BGH PolyA之間。

6、再將CAG-DysG-BGH片段從pGEM-T Easy載體上切下，連入本室構(gòu)建的新型核糖體基因區(qū)打靶載體pHr2-nl中，得到DMD基因治療載體pHr2-nl-CDysG。(2)采用核轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染單細(xì)胞化的DFiPS細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后加入Y27632提高細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果:(1)構(gòu)建的載體pHr2-nl-CDysG經(jīng)PmeⅠ和AhdⅠ酶切鑒定，所獲得的酶切片段大小與理論值相符。(2)載體pHr2-nl-CDysG的測序結(jié)果與