人小腸黏膜潘氏細(xì)胞形態(tài)學(xué)和功能作用研究.pdf

1、研究目的:1、觀察并比較人小腸各段潘氏細(xì)胞的分布，形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。分析與其功能之間的關(guān)系。 2、通過(guò)透射電子顯微鏡展示處于不同分泌時(shí)相的人小腸潘氏細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)等形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。 3、觀察并分析潘氏細(xì)胞脫顆粒與小腸黏膜上皮細(xì)胞增殖狀態(tài)之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)方法 一、材料和方法:1、1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本選取及分組：取自中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院2005年3月至2005年10月間，胃腸胰外科病人手術(shù)切除的小腸標(biāo)本共24例，其中包括十二指腸8例，

2、空腸8例，回腸8例。8例十二指腸標(biāo)本及8例空腸標(biāo)本來(lái)源于5位男性(平均年齡51.8±8.0歲)，3位女性(平均年齡53.6±11.0歲)，病種包括胃、十二指腸腸良性潰瘍4例，早期胃癌4例，均行畢Ⅱ式胃-空腸吻合，分別取十二指腸殘端及距離Tris韌帶15-20cm處的空腸黏膜一小塊。8例回腸標(biāo)本來(lái)源于6位男性(平均年齡55.6±12.0歲)，2位女性(分別61，53歲)，手術(shù)病種包括升結(jié)腸癌4例，升結(jié)腸多發(fā)性憩室1例，均行右半結(jié)腸切除術(shù)；

3、因直腸癌行預(yù)防性回腸造口后，回腸末端關(guān)瘺術(shù)3例；分別取距離回盲部10-15cm的末端回腸或回腸造瘺口近端黏膜各一小塊.所有標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為正常小腸黏膜組織.三組患者在年齡和性別分布、疾病構(gòu)成，分期及有無(wú)其它共患病等方面差異無(wú)顯著性。排除激素，免疫抑制劑等藥物及炎癥性腸病等疾病因素的影響，所有患者術(shù)前未接受過(guò)放療、化療及抗生素治療。 1、2標(biāo)本處理標(biāo)本切除后立即投入液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍保存直至使用。取所存標(biāo)本經(jīng)冷

4、生理鹽水漂洗5分鐘后，10％中性福爾馬林溶液固定24小時(shí)以上，脫水，然后行常規(guī)石蠟包埋。制成3-5um石蠟切片后，蘇木素—伊紅(HE)染色，行常規(guī)病理組織學(xué)檢查和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、溶菌酶(Lysozyme)免疫組化染色檢測(cè)。 1、3人小腸黏膜潘氏細(xì)胞(PCs)及人回腸上皮增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組化染色人小腸黏膜潘氏細(xì)胞(PCs)染色采用溶菌酶免疫組化染色方法。免疫組化試劑盒均購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司。石蠟包

5、埋的組織塊在切片機(jī)上行3～5μm切片；常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化：磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.4)沖洗3次，每次5分鐘(下同)；微波熱修復(fù)抗原30分鐘，每張切片加50ul過(guò)氧化酶阻斷溶液，室溫孵育10分鐘；PBS沖洗3次；加50ul的正常非免疫動(dòng)物血清，室溫孵育10分鐘，傾去血清，勿洗；加50ul的Lysozyme多克隆抗體或PCNA單抗，4℃下孵育過(guò)夜；PBS洗3次；加50ul生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C，黃色液體)，室溫下孵育30分

6、鐘；PBS洗3次；加50ul鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化酶溶液，室溫下孵育30分鐘；PBS洗3次；每張切片100ul新鮮配制的DAB溶液，顯色3-10分鐘；自來(lái)水充分沖洗10分鐘；蘇木素復(fù)染2分鐘；PBS或自來(lái)水沖洗返藍(lán)；梯度酒精脫水干燥；透明；中性樹膠封固。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以淋巴瘤組織作為PCNA陽(yáng)性對(duì)照。 1、4人小腸潘氏細(xì)胞計(jì)數(shù)及回腸黏膜上皮細(xì)胞PCNA增殖指數(shù)檢測(cè)在普通光鏡下觀察十二指腸，空腸，回腸PCs的形態(tài)、

7、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、分泌顆粒的染色情況及分段細(xì)胞記數(shù)； 溶菌酶陽(yáng)性的潘氏細(xì)胞計(jì)數(shù)(x±s)：10×40視野下觀察，按確定的方向依次計(jì)數(shù)10個(gè)結(jié)構(gòu)顯示良好，染色清晰的隱窩腔，計(jì)算其中LZM染色陽(yáng)性PCs數(shù)量，總數(shù)即為每10個(gè)隱窩LZM染色陽(yáng)性的PCs數(shù)，每組大鼠可得8個(gè)數(shù)值。，計(jì)量資料以x±SD表示。 細(xì)胞核著棕黃色判定為PCNA陽(yáng)性染色細(xì)胞，每張回腸PCNA染色切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野選擇3條絨毛，計(jì)數(shù)每條絨毛中陽(yáng)性細(xì)胞

8、數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，PCNA指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％。 1、5人小腸潘氏細(xì)胞顆粒分泌狀態(tài)分析采用KontronIBAS2.0全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，在40×10倍視野下觀察，每張回腸潘氏細(xì)胞Lysozyme免疫組化切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)算每一測(cè)試區(qū)域的灰度級(jí)GA和面積(m+n)、陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的灰度級(jí)Gα和面積n(或背景面積m)。測(cè)試儀器最大灰度分級(jí)(Gmax)為256。應(yīng)用免疫組織化學(xué)定量計(jì)算公式：PU=100×|Ga-GA

9、|/Gmax×[1-(n/m+n)]，導(dǎo)出陽(yáng)性單位(PU)數(shù)值，每張切片均可得出一平均PU值，其數(shù)值大小即可說(shuō)明潘氏細(xì)胞顆粒含量的多少。并進(jìn)一步分析潘氏細(xì)胞的顆粒分泌狀態(tài)與小腸黏膜上皮細(xì)胞增殖之間的關(guān)系。 1、6透射電鏡下人回腸潘氏細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)另取回腸1mm×1mm×2mm大小的組織塊置2.5％戊二醛中固定，透射電鏡下觀察不同分泌時(shí)期PCs超微結(jié)構(gòu)特征。 二、檢測(cè)指標(biāo)：1、光鏡下觀察人小腸各段潘氏細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及

10、分布。 2、透視電鏡下觀察不同狀態(tài)下人潘氏細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征。 3、人回腸黏膜上皮細(xì)胞PCNA增殖指數(shù)的檢測(cè)。 4、圖像分析系統(tǒng)對(duì)潘氏細(xì)胞顆粒進(jìn)行定量分析，并分析潘氏細(xì)胞脫顆粒與小腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖及多能干細(xì)胞之間的關(guān)系。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，多組的PCs計(jì)數(shù)采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差

11、異有明顯顯著性。上述檢驗(yàn)均采用SAS8.1版本統(tǒng)計(jì)軟件包在電腦上運(yùn)行。 結(jié)論:1、在一般情況下，人小腸潘氏細(xì)胞僅存在于小腸，由十二指腸向下至空腸，回腸，細(xì)胞數(shù)量呈遞增分布。人結(jié)腸中未見有潘氏細(xì)胞。 2、人潘氏細(xì)胞位于小腸黏膜隱窩的基底部，呈簇狀分布，細(xì)胞形態(tài)為錐形柱狀，細(xì)胞核位于細(xì)胞基底部，其胞質(zhì)中含有一定數(shù)量的分泌顆粒，分泌顆粒溶菌酶染色為陽(yáng)性。 3、透射電鏡下見人小腸潘氏細(xì)胞具有腸內(nèi)分泌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征。處于

12、分泌期的潘氏細(xì)胞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴(kuò)張和發(fā)達(dá)的高爾基體，線粒體明顯腫脹，脫顆粒后潘氏細(xì)胞核上胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡樣變。但細(xì)胞核沒有顯示凋亡改變，潘氏細(xì)胞脫顆粒是一主動(dòng)過(guò)程，顆粒分泌與否并不是由于細(xì)胞的凋亡引起。 4、人潘氏細(xì)胞顆粒分泌與小腸黏膜細(xì)胞的增殖狀態(tài)有關(guān)，反映在潘氏細(xì)胞脫顆粒時(shí)，其小腸黏膜增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)指數(shù)增高。PCNA指數(shù)在一定程度上可以反應(yīng)腸上皮干細(xì)胞的增殖狀態(tài)，檢測(cè)PCNA指數(shù)變化即反應(yīng)腸黏膜上皮損