醫(yī)用臭氧瘤內(nèi)注射治療移植性兔VX2腫瘤的實驗研究.pdf

1、背景
　　 醫(yī)用臭氧發(fā)展有近50年歷史,在歐洲等地醫(yī)用臭氧(以下簡稱臭氧)用于治療糖尿病足、創(chuàng)傷及皮膚潰瘍的愈合、腦中風(fēng)、潰瘍性結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎、椎間盤突出癥等疾病,臨床療效得到了肯定。
　　 目的
　　 以兔VX2移植瘤為實驗對象,采用不同濃度的臭氧行經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射,并采用瘤內(nèi)注射純氧及空白治療作為對照,觀察不同濃度臭氧的治療療效,同時闡述其治療機理。
　　 結(jié)果
　　 一、動物模型制作及治療:

2、
　　 兔右側(cè)臀部外側(cè)大腿根部皮下VX2瘤株接種成功率85％,共計有34只瘤兔造模成功,接種14d,體外測量腫瘤直徑為2.06±0.93cm。
　　 二、術(shù)后觀察
　　 (一)、一般情況:各組實驗兔治療后反應(yīng),活動及進(jìn)食情況與術(shù)前相比較無明顯變化。
　　 (二)、療效評估
　　 1.空白組和純氧組:兩組瘤兔腫瘤長徑及短徑均較前明顯增大,空白組長徑4.10±0.71cm；短徑3.29±0.60cm。

3、純氧組長徑3.73±0.51cm；短徑3.34±0.50cm。兩組腫瘤標(biāo)本表現(xiàn)相似:腫瘤形態(tài)欠規(guī)則,部分為類圓形,部分近似長方形。切面呈灰紅色,鮮嫩似魚肉狀,有光澤,中心區(qū)域可見乳白色液化壞死,壞死范圍長徑1～2cm。空白組和純氧組共計有9只瘤兔解剖后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶?？瞻捉M:3只瘤兔臀部瘤灶附近可見腫大淋巴結(jié)(其中一只合并肺轉(zhuǎn)移)；1只瘤兔單獨出現(xiàn)肺臟轉(zhuǎn)移瘤；1只瘤兔單獨出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移瘤。純氧組:3只瘤兔臀部瘤灶附近可見腫大淋巴結(jié)(其中1只合

4、并有肝臟轉(zhuǎn)移)；1只瘤兔單獨出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移。
　　 2.50μg組和75μg組(臭氧組,下同)瘤兔腫瘤較治療前相比較增大不明顯,50μg組腫瘤長徑2.41±0.37cm；短徑2.28±0.27cm。75μg組腫瘤長徑2.41±0.32cm；腫瘤短徑2.27±0.29cm。兩組腫瘤標(biāo)本表現(xiàn)相似:瘤體色暗紅,局部可見充血腫脹,中心區(qū)域可見淺黃色及少許乳白色相雜壞死,瘤腔內(nèi)壞死物部分可見液化,壞死腔較小,壞死范圍長徑0.5～1cm。臭氧

5、組2只瘤兔股部出現(xiàn)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),其它部位未見轉(zhuǎn)移灶。臭氧組和空白組及純氧組三組間腫瘤轉(zhuǎn)移率相比較顯示總體間有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.01),空白組腫瘤轉(zhuǎn)移率最高(71.4％):純氧治療組次之(50.0％)；臭氧治療組腫瘤轉(zhuǎn)移率最低(11.8％)
　　 3.各組間腫瘤最長徑和最短徑進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較,腫瘤長徑50μg組和75μg組顯著低于空白組及純氧組(P<0.05)；50μg組和75μg組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.995)；空白組

6、和純氧組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.148)。腫瘤短徑50μg組和75μg組顯著低于空白組及純氧組(P<0.05)；50μg組和75μg組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=1.000):空白組和純氧組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000)。
　　 4.各組間瘤重分別是:空白組27.57±6.29g；50μg組17.63±3.30g；75μg組19.89±3.66g；純氧組27.50±7.76g。50μg和75μg組腫瘤瘤重顯著低于空白

7、組及純氧組(P<0.05)；臭氧組之間相比較無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.403)；純氧組和空白組相比較無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.980)。
　　 (三)、外周靜脈血檢測
　　 治療前1d抽取外周靜脈血檢查NKC和細(xì)胞因子IL-2、TNFα、IFNγ數(shù)值,治療14d后再次抽取靜脈血測量上述數(shù)值(各組數(shù)字詳見正文)。50μg組和75μg組NKC、IL-2、TNFα、IFN,數(shù)值均顯著高于空白組及純氧組,各組間差值(差值=治療

8、后數(shù)值-治療前數(shù)值)行統(tǒng)計學(xué)兩兩比較:50μg組和75μg組顯著高于空白組及純氧組(P<0.05)；NKC、IL-2及IFNγ差值50μg組和75μg組之間相比較無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；TNFα差值50μg組和75μg組之間相比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；空白組和純氧組NKC及細(xì)胞因子差值之間相比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。治療前后各組間NKC及細(xì)胞因子數(shù)值(各組數(shù)字見正文)前后進(jìn)行配對t檢驗顯示:NKC空白組及臭氧治

9、療組治療前后相比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；純氧組治療前后無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。臭氧組細(xì)胞因子前后數(shù)值比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；空白組及純氧組前后細(xì)胞因子數(shù)值相比較無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (四)、病理檢查
　　 1.HE染色光鏡檢查,①空白組和純氧組:VX2腫瘤組織呈浸潤性生長,部分腫瘤細(xì)胞突破肌肉,沿肌間隙生長,腫瘤細(xì)胞排列紊亂,可見多個癌巢,細(xì)胞核較大,大部分核呈異性,核質(zhì)顆粒較粗,

10、細(xì)胞間界限不清,可見粗大的腫瘤血管。部分組織切片可見少許腫瘤細(xì)胞破裂溶解,并可見正常腫瘤細(xì)胞內(nèi)少許腫瘤壞死區(qū)。②臭氧組:腫瘤細(xì)胞與周邊組織界限清晰,未見明顯侵犯,腫瘤細(xì)胞可見大片凝固性壞死,癌巢較少見,瘤細(xì)胞大量溶解破裂,僅見少許腫瘤細(xì)胞存在,胞內(nèi)結(jié)構(gòu)破壞明顯,細(xì)胞核不大,細(xì)胞間界限較清,瘤組織局部微血管充血、擴(kuò)張,可見部分灶性出血點。
　　 2.免疫組織化學(xué)檢測
　　 ①PCNA陽性染色為細(xì)胞核膜周圍及核內(nèi)被染成黃色或

11、棕黃色,呈顆粒狀或彌漫樣分布。PCNA陽性細(xì)胞呈彌漫樣、小片狀或顆粒樣散在分布。各組間LI分別為空白組69.74±7.17％；50μg組37.26±7.42％；75μg組35.38±5.92％；純氧組73.04±8.70％。各組間統(tǒng)計學(xué)兩兩比較:50μg組和75μg組LI顯著低于空白組及純氧組(P=0.000)；50μg組和75μg組之間相比較無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.601)；空白組和純氧組之間相比較,無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.392

12、)。
　　 ②MVD陽性染色為腫瘤組織中內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的棕黃色,腫瘤微血管分布不均,表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性,以癌巢周邊特別是腫瘤周邊比較密集,壞死的腫瘤組織周邊也可見到血管分布。MVD分別為空白組38.50±3.49；50μg組25.51±3.00:75μg組24.64±4.24；純氧組37.68±3.66。各組間兩兩比較:50μg組和75μg組顯著低于空白組及純氧組(P=0.000)；50μg組和75μg組之間相比較無顯著統(tǒng)

13、計學(xué)意義(P=0.629)；空白組和純氧組之間相比較,無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.666)。
　　 ③bcl-2和bax陽性染色為棕黃色,染色位于bcl-2和bax蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞胞漿,呈彌漫性分布,核膜周圍最濃,可見棕黃色顆粒。各組間bcl-2蛋白表達(dá)IOD分別是空白組25.28±9.66；50μg組9.63±1.67；75μg組9.35±1.03；空白組20.92±8.50。各組間bax蛋白表達(dá)IOD分別是空白組7.51±1.

14、77；50μg組17.68±4.99；75μg組17.25±7.09；純氧組8.46±1.52。bcl-2蛋白表達(dá)IOD各組間兩兩比較:50μg組和75μg組顯著低于空白組及純氧組(P<0.05)；50μg組和75μg組之間相比較無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.998)；空白組和純氧組之間相比較,無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.919)。bax蛋白表達(dá)IOD各組間統(tǒng)計學(xué)兩兩比較:50μg組和75μg組顯著高于空白組及純氧組(P<0.05)；50μg

15、組和75μg組之間相比較無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000)；空白組和純氧組之間相比較,無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.831)。
　　 ④TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞,凋亡細(xì)胞體積明顯縮小,斷裂為多個碎塊狀；凋亡細(xì)胞核呈棕色,顯示細(xì)胞核內(nèi)有原位斷端修復(fù)酶表達(dá)。臭氧組觀察切片后發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞核呈棕黃色,細(xì)胞凋亡多而廣泛,染色質(zhì)凝聚濃縮?？瞻捉M和純氧組可見少許凋亡細(xì)胞,散在分布,細(xì)胞核染色較淡。分別計算各組的腫瘤AI:空白組14.86±5.34

16、％；50μg組66.75±12.27％；75μg組73.22±12.80％；純氧組14.25±3.50％。
　　 結(jié)論
　　 1.療效總結(jié):采用經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)直接注射臭氧治療移植性兔VX2腫瘤,可有效控制腫瘤的生長,減少腫瘤轉(zhuǎn)移,純氧無明顯抑制效應(yīng)。
　　 2.機理總結(jié):①臭氧為強氧化劑,注入機體后生成活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)和氧自由基,具有明顯的細(xì)胞毒性作用,能夠直接殺死腫瘤