活性氧在高糖誘導(dǎo)的牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞代謝記憶中的作用.pdf

1、第一章選擇性培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞
　　 目的:選擇性培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用膠原酶消化選擇性培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性、倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);
　　 2.用α-平滑肌肌動蛋白(α-SAM)抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體、Ⅷ因子相關(guān)抗原(vWf)抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色鑒定牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞;
　　 3.應(yīng)用CCK-8法測定牛

2、視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的增殖情況并繪制細(xì)胞生長曲線。
　　 結(jié)果:
　　 1.膠原酶消化可獲得具有良好活性的毛細(xì)血管碎片，臺盼蘭染色顯示細(xì)胞活力大于96％。原代培養(yǎng)1天后可見細(xì)胞從貼壁的毛細(xì)血管碎片放射狀長出，3-5天后大量細(xì)胞從血管碎片遷移長出，5-7天后細(xì)胞呈長梭形，形成較大的克隆，9-10天后細(xì)胞呈短梭形達(dá)到融合狀態(tài)呈可重疊生長;傳代后，1小時以內(nèi)細(xì)胞貼壁，1天后可見細(xì)胞完全展開，5-7天左右可以傳代一次。細(xì)胞傳代到第

3、3代(P3)后逐漸出現(xiàn)老化狀態(tài)。
　　 2.免疫組織化學(xué)染色顯示細(xì)胞對α-SAM單克隆抗體染色陽性，陽性率＞98％;而對GFAP抗體和vWf抗體染色陰性。
　　 3.細(xì)胞生長曲線顯示，第2代細(xì)胞(P2)第4天進(jìn)入對數(shù)生長期，第10天進(jìn)入平臺期。
　　 結(jié)論:
　　 1.經(jīng)膠原酶消化成功地培養(yǎng)出具有高純度和可傳代的牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞。
　　 2.選擇P2-P3代細(xì)胞能夠更好的應(yīng)用于后續(xù)的試驗。

4、r>　　 第二章高糖誘導(dǎo)的牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞“代謝記憶”現(xiàn)象
　　 目的:探討牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞(BRPs)從高糖培養(yǎng)轉(zhuǎn)換為正常葡萄糖培養(yǎng)條件后細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的變化。
　　 方法:
　　 1.BRPs高糖(20mM、25mM、30mM)條件下培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)換為正常葡萄糖(5.6mM)條件下培養(yǎng)2天（2d-2d）、4天（2d-4d）或6天(2d-6d);或者在高糖(20mM、25mM、30mM)條件下培養(yǎng)4

5、天后轉(zhuǎn)換為正常葡萄糖(5.6mM)條件下培養(yǎng)2天（4d-2d）或4天(4d-4d);各時間段以全程正常葡萄糖或高糖條件下培養(yǎng)2、4、6、8天作為對照;細(xì)胞活力用CCK-8法評估。
　　 2.BRPs30mM高糖條件下培養(yǎng)4天后轉(zhuǎn)換為正常葡萄糖(5.6mM)條件下培養(yǎng)4天（30mM4d-5.6mM4d），正常葡萄糖(5.6mM)或高糖(30mM)條件下培養(yǎng)4、8天作為對照;細(xì)胞凋亡的檢測通過ELISA檢測核小體DNA片段以及Wes

6、tern-blot檢測活化的Caspase-3蛋白表達(dá)來評估。
　　 結(jié)果:
　　 1.20mM和25mM高糖刺激BRPs2天后，細(xì)胞活力顯著降低;轉(zhuǎn)換為5.6mM正常葡萄糖培養(yǎng)4天后細(xì)胞活力才完全恢復(fù)。30mM高糖刺激BRPs2天后，細(xì)胞活力顯著降低;轉(zhuǎn)換為5.6mM正常葡萄糖培養(yǎng)，直到6天后細(xì)胞活力才完全恢復(fù)。
　　 2.20mM和25mM高糖刺激BRPs4天后，細(xì)胞活力顯著降低;即使在轉(zhuǎn)換為5.6mM正常葡

7、萄糖培養(yǎng)4天后，細(xì)胞活力仍未完全恢復(fù)。30mM培養(yǎng)條件下刺激BRPs4天后，細(xì)胞活力顯著降低;但即使在轉(zhuǎn)換為5.6mM正常葡萄糖培養(yǎng)4天后，細(xì)胞活力仍然持續(xù)性的降低。
　　 3.30mM高糖刺激BPRs4天后，細(xì)胞凋亡顯著增加;即使轉(zhuǎn)換為5.6mM正常葡萄糖培養(yǎng)4天后，細(xì)胞凋亡的異常增加仍然持續(xù)存在。
　　 結(jié)論:
　　 1.BRPs在30mM高糖條件下培養(yǎng)4天，細(xì)胞活力減低、細(xì)胞凋亡增多;即使轉(zhuǎn)換為5.6mM正

8、常葡萄糖條件下培養(yǎng)4天后，這種異常仍然持續(xù)存在，呈現(xiàn)“代謝記憶”現(xiàn)象。
　　 2.之前高糖刺激的時間、糖濃度以及之后轉(zhuǎn)換為正常葡萄糖培養(yǎng)后的時間決定了這種“代謝記憶”的預(yù)后。
　　 第三章活性氧在高糖誘導(dǎo)的牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞代謝記憶現(xiàn)象中的作用及機(jī)理
　　 目的:探討活性氧(ROS)及抗氧化物酶在高糖誘導(dǎo)的牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞(BRPs)代謝記憶現(xiàn)象中的作用及機(jī)理。
　　 方法:30mM高糖培養(yǎng)BRPs

9、4天后轉(zhuǎn)換為5.6mM正常葡萄糖培養(yǎng)4天;5.6mM正常葡萄糖以及30mM高糖條件下培養(yǎng)細(xì)胞4或8天作為對照。檢測各組線粒體產(chǎn)生的ROS、錳超氧化物歧化酶(MnSOD)活性、MnSOD蛋白以及mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.30mM高糖培養(yǎng)BRPs4天后，細(xì)胞線粒體ROS量明顯增多、MnSOD蛋白活性明顯減少;即使轉(zhuǎn)換為正常葡萄糖培養(yǎng)4天后，這種異常仍然持續(xù)存在。
　　 2.30mM高糖培養(yǎng)BRPs4天

10、后，MnSOD蛋白及mRNA表達(dá)反應(yīng)性增高;延長30mM高糖培養(yǎng)到8天或轉(zhuǎn)換為5.6mM正常葡萄糖培養(yǎng)4天，MnSOD蛋白及mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.線粒體ROS增多、MnSOD蛋白活性的降低介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的BRPs代謝記憶。
　　 2.MnSOD的轉(zhuǎn)錄降低涉及到BRPs代謝記憶，靶向作用于抗氧化物酶可能是一種潛在的方案去逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的BRPs代謝記憶。
　　 第四章錳超氧

11、化物歧化酶對牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞代謝記憶現(xiàn)象保護(hù)作用
　　 目的:探討過表達(dá)錳超氧化物歧化酶(MnSOD)對高糖誘導(dǎo)的牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞(BRPs)代謝記憶的保護(hù)作用。
　　 方法:
　　 1.rAAV2-MnSOD轉(zhuǎn)染BRPs，轉(zhuǎn)染4、8天后檢測細(xì)胞MnSOD蛋白的表達(dá)以及其活性。
　　 2.rAAV2-MnSOD預(yù)處理BRPs，檢測其對30mM高糖培養(yǎng)BRPs4天轉(zhuǎn)換為5.6mM正常葡萄糖培養(yǎng)4天后

12、，線粒體活性氧(ROS)、細(xì)胞凋亡以及活化的Caspase-3蛋白表達(dá)的影響，未處理組以及5.6mM正常葡萄糖或30mM高糖培養(yǎng)8天作為對照。
　　 結(jié)果:
　　 1.rAAV2-MnSOD轉(zhuǎn)染BRPs，4天后細(xì)胞MnSOD蛋白表達(dá)及活性明顯增高，蛋白表達(dá)較對照組增加近2倍，MnSOD活性增高近1倍;轉(zhuǎn)染8天后仍然檢測到MnSOD蛋白的高表達(dá)并伴有蛋白活性的增高。
　　 2.rAAV2-MnSOD預(yù)處理BRPs后