順鉑、VP-16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞影響的比較研究.pdf

1、目的：卵巢惡性生殖細(xì)胞腫瘤(malignant ovarian germ cell tumors，MOGCTs)，是來(lái)源于原始生殖細(xì)胞的一組卵巢惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于上皮性腫瘤，好發(fā)于兒童及青少年。因此保留生育功能的手術(shù)聯(lián)合術(shù)后化療顯得至關(guān)重要。多數(shù)惡性生殖細(xì)胞腫瘤對(duì)化療極其敏感，化療已成為非常重要的治療手段。但化療藥物可引起多種不良反應(yīng)，對(duì)多個(gè)器官系統(tǒng)造成損害，嚴(yán)重影響女性患者的生活質(zhì)量，尤其對(duì)因卵巢功能損害而導(dǎo)致的月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)、早

2、絕經(jīng)和不孕近年來(lái)日益得到學(xué)者們的關(guān)注。
　　 以不同濃度的順鉑、VP-16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素作用于人卵巢惡性生殖細(xì)胞腫瘤畸胎瘤細(xì)胞株P(guān)A-1，四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測(cè)順鉑、VP-16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素對(duì)惡性畸胎瘤PA-1細(xì)胞株的半數(shù)致死量，以上述四種藥物的半數(shù)致死量作用于人卵巢顆粒細(xì)胞，探討順鉑、VP-16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)及其功能的影響。
　　 方法：
　　 1、體外培養(yǎng)人卵巢

3、生殖細(xì)胞腫瘤畸胎瘤細(xì)胞株P(guān)A-1，將其按常規(guī)方法培養(yǎng)于含10％的胎牛血清及青、鏈霉素(100U/ml)的MEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2、恒溫、飽和濕度條件下培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25％的胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液備用。
　　 2、將PA-1細(xì)胞株以細(xì)胞密度為6.5×104/孔接種于96孔板中，加入不同濃度的順鉑、VP-16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素，作用48h后，MTT比色法觀察其對(duì)PA-1細(xì)胞株的生長(zhǎng)增殖作用，并測(cè)定

4、其半數(shù)致死量(IC50)。
　　 3、人卵巢顆粒細(xì)胞收集取自2010年3月～2010年11月期間在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的卵泡穿刺術(shù)患者，均為輸卵管不通或男性原因不孕的女性，月經(jīng)周期，排卵功能及內(nèi)分泌功能均正常。長(zhǎng)周期方案超促排卵婦女，注射人絨毛膜促性腺激素34～36h后，在B型超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。
　　 4、體外培養(yǎng)人卵巢顆粒細(xì)胞以對(duì)PA-1細(xì)胞株的半數(shù)致死量的順鉑、VP-

5、16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素作用于人卵巢顆粒細(xì)胞72h后，MTT比色法測(cè)定對(duì)顆粒細(xì)胞活性的影響，化學(xué)發(fā)光法測(cè)定顆粒細(xì)胞上清液雌激素水平，免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察顆粒細(xì)胞Bcl-2/Bax表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、順鉑、VP-16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素對(duì)人卵巢惡性生殖細(xì)胞腫瘤畸胎瘤細(xì)胞株P(guān)A-1的影響
　　 1.1 PA-1細(xì)胞株的生長(zhǎng)情況
　　 倒置相差顯微鏡下觀察，PA-1細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈梭形，加入

6、化療藥物后，有些細(xì)胞由伸展開(kāi)的梭形變?yōu)閳A形，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞膜開(kāi)始皺縮，圓形細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞體積逐漸變小，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞膜不再完整，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞的貼壁能力降低，最后漂浮。
　　 1.2 MTT比色法檢測(cè)順鉑、VP-16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素對(duì)PA-1細(xì)胞株的半數(shù)致死量
　　 不同濃度的順鉑、VP-16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素作用于PA-1細(xì)胞株48h后均出現(xiàn)隨著劑量的增大抑制作用增強(qiáng)，其半數(shù)致死量分別為順鉑0.

7、55mg/L，VP-161.67 mg/L，長(zhǎng)春新堿1.8μg/L，博來(lái)霉素1.7 mg/L。
　　 2、對(duì)惡性畸胎瘤PA-1細(xì)胞株的半數(shù)致死量的順鉑、VP-16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞的影響
　　 2.1人卵巢顆粒細(xì)胞體外生長(zhǎng)情況
　　 經(jīng)苔盼藍(lán)染色，細(xì)胞成活率達(dá)90％以上。
　　 倒置相差顯微鏡下觀察，人卵巢顆粒細(xì)胞剛接種時(shí)細(xì)胞呈圓形，6h后貼壁，24h后貼壁達(dá)到90％以上，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則呈

8、梭形，細(xì)胞核大，圓形，HE染色后細(xì)胞漿富含空泡及顆粒。細(xì)胞有聚集生長(zhǎng)現(xiàn)象。
　　 2.2 MTT比色法檢測(cè)結(jié)果
　　 與空白對(duì)照組相比，順鉑、VP-16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素組吸光度值均有所降低，除長(zhǎng)春新堿組外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，組間比較，除VP-16與博來(lái)霉素組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)外，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 2.3 E2水平檢測(cè)結(jié)果
　　 與空白對(duì)照組相比，順

9、鉑、VP-16、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素組人卵巢顆粒細(xì)胞分泌E2水平均有所減少，除長(zhǎng)春新堿組外，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，組間比較，除VP-16與博來(lái)霉素組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)外，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 2.4免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2/Bax結(jié)果
　　 光鏡下觀察Bcl-2/Bax定位于細(xì)胞漿，為棕黃色細(xì)密顆粒。本研究免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和各處理組均有Bcl-2/Bax

10、表達(dá)。各組Bax表達(dá)較空白對(duì)照組有所增強(qiáng)，Bcl-2表達(dá)有所減弱。除長(zhǎng)春新堿組外，各組與空白對(duì)照組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、VP-16、博來(lái)霉素、順鉑、長(zhǎng)春新堿作用于惡性畸胎瘤PA-1細(xì)胞株48h后均出現(xiàn)隨著劑量的增大而抑制作用逐漸增強(qiáng)。
　　 2、VP-16、博來(lái)霉素、順鉑、長(zhǎng)春新堿作用于惡性畸胎瘤PA-1細(xì)胞株48h的半數(shù)致死量分別為VP-161.67 mg/L，博來(lái)霉素

11、1.7 mg/L，順鉑0.55mg/L，長(zhǎng)春新堿1.8μg/L。
　　 3、對(duì)惡性畸胎瘤PA-1細(xì)胞株48h半數(shù)致死量的VP-16、博來(lái)霉素、順鉑對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞有顯著促凋亡作用，長(zhǎng)春新堿促凋亡作用不明顯。
　　 4、對(duì)惡性畸胎瘤PA-1細(xì)胞株48h半數(shù)致死量的VP-16、博來(lái)霉素、順鉑作用于人卵巢顆粒細(xì)胞，使其分泌E2能力有所下降，而長(zhǎng)春新堿對(duì)其分泌E2的影響不明顯。
　　 5、VP-16、博來(lái)霉素、順鉑、長(zhǎng)春