BTLA信號在T細胞活化啟動和早期階段的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、BTLA是2003年發(fā)現(xiàn)的Ig家族成員，是與CTLA-4及PD-1類似的抑制性受體。人的BTLA基因定位于染色體3q13.2，與小鼠具有48％的同源性。BTLAmRNA在脾臟及淋巴結(jié)組織中高表達，在腎臟、肝臟、肺、腦、心臟及肌肉等組織中表達量都很低，甚至不表達。BTLA廣泛表達于T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和NK細胞表面。
　　 BTLA含有一個信號序列、一個免疫球蛋白可變區(qū)(IgV)樣的胞外段、跨膜區(qū)和大約100個氨基

2、酸的胞漿區(qū)。BTLA胞漿區(qū)存在3個重要的含酪氨酸殘基的基序:潛在的Grb2結(jié)合位點，免疫受體酪氨酸抑制基序和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序。研究表明，BTLA與其配體HVEM結(jié)合可以抑制T細胞的增殖和細胞因子的分泌，推遲細胞周期的進程，從而抑制或終止免疫應(yīng)答。在持續(xù)的抗原刺激下，BTLA高度選擇性表達在無能CD4+T細胞上，表明BTLA信號在誘導(dǎo)與維持T細胞無能狀態(tài)的過程中有重要作用。另外，BTLA不僅在在維持外周免疫耐受中具有重要作用，還可以

3、預(yù)防自身免疫疾病的發(fā)生，終止炎癥反應(yīng)，抑制移植免疫應(yīng)答。
　　 BTLA在初始和活化T細胞上都有表達，因此，Murphy提出BTLA可能在T細胞活化的各個階段尤其是早期階段發(fā)揮作用。本研究首先分析了BTLA-HVEM順式復(fù)合物的存在對細胞表面BTLA分子表達水平檢測的影響，進而研究了BTLA在T細胞活化起始和早期階段的調(diào)節(jié)作用。
　　 一、BTLA-HVEM順式復(fù)合物對細胞表面BTLA分子檢測的影響
　　 [目的

4、]T細胞和U937細胞表面存在BTLA和HVEM共表達的現(xiàn)象。探討B(tài)TLA-HVEM順式復(fù)合物存在對細胞表面BTLA分子檢測的影響。
　　 [方法]分離人外周血單個核細胞，經(jīng)陰性選擇磁珠分離純化獲得T淋巴細胞。采用流式細胞術(shù)的方法，用抗不同BTLA位點的商品化單抗MIH26和本室研制的單抗8H9分別檢測U937和T細胞等細胞表面BTLA分子的表達水平。293T/BTLA基因轉(zhuǎn)染細胞上BTLA分子的檢測采用8H9單抗。
　　

5、 [結(jié)果]商品化單抗MIH26(0.5μg)檢測T細胞和U937細胞上BTLA分子的表達量分別為90％以上，而8H9單抗（1μg）檢測到二者的表達水平分別為42.2％、30.8％。采用0.02μg和0.05μg的8H9單抗檢測293T/BTLA轉(zhuǎn)基因細胞株，顯示BTLA分子的表達量分別為80％和91.4％。
　　 [結(jié)論]T細胞和U937細胞上共表達的BTLA和HVEM形成順式復(fù)合物，影響8H9對BTLA的檢測，而不影響MIH

6、26的檢測。
　　 二、BTLA對T細胞活化啟動和早期階段的調(diào)節(jié)作用。
　　 [目的]觀察BTLA在T細胞活化過程中的表達變化，探討其在T細胞活化各個階段尤其是早期階段的抑制作用。
　　 [方法]分離人外周血單個核細胞，經(jīng)磁珠分選獲得純化的T細胞。用激發(fā)型CD3抗體和CD28抗體刺激T細胞活化，采用流式細胞術(shù)，檢測BTLA、CTLA-4和PD-1在T細胞活化過程中的動態(tài)表達。激發(fā)型CD3抗體和CD28抗體在加入B

7、TLA單抗8H9的情況下刺激T細胞活化，流式細胞術(shù)檢測T細胞活化早期標志分子CD25和CD69的表達。激發(fā)型CD3抗體和CD28抗體聯(lián)合HVEM-Fc或者BTLA單抗8H9，觀察BTLA信號在活化后的不同時間對T細胞增殖的作用。同時，采用ELISA方法檢測8H9對CD3單抗聯(lián)合CD28單抗刺激的T細胞分泌IL-2和IFN-γ的影響。預(yù)先用CD3和CD28抗體刺激T細胞活化后，在24h，48h，72h分別加入8H9抗體并交聯(lián)，觀察缺失BT

8、LA信號對T細胞活化抑制的減弱程度。
　　 [結(jié)果]BTLA在T細胞上組成性高表達，活化后表達有所降低，然后迅速回升;CTLA-4在靜止T細胞上不表達，PD-1的表達水平很低，二者都是活化后被誘導(dǎo)表達。激發(fā)型CD3抗體和CD28抗體聯(lián)合8H9刺激T細胞后，CD25和CD69的表達均受到抑制。激發(fā)型CD3抗體和CD28抗體聯(lián)合8H9或者HVEM-Fc刺激后，在刺激后的1d，2d，3d，4d檢測，均對T細胞有抑制作用。同時，8H9對