P53抑制劑誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景
　　近年來(lái)冠心病(CoronaryHeartDisease,CHD)發(fā)病率逐年增加，特別是心肌梗死(MyocaridalInfarction,MI)等導(dǎo)致的缺血性心肌病(IschemicCardiomyopathy,ICM)已成為影響人類(lèi)健康的主要疾病之一。最近研究表明心肌梗死后也有少量的心肌細(xì)胞發(fā)生分裂增殖，但是分裂增殖的細(xì)胞數(shù)量偏少，每年1％更新率不足以彌補(bǔ)心肌梗死時(shí)大量心肌細(xì)胞的壞死。因此心肌梗死引起的大量心肌細(xì)胞

2、壞死最終導(dǎo)致缺血性心肌病的發(fā)生，引發(fā)嚴(yán)重心力衰竭和各種心血管并發(fā)癥，五年死亡率高達(dá)45％左右。盡管冠心病的藥物治療、外科搭橋技術(shù)和介入治療技術(shù)不斷提高，但是死亡率仍居高不下。因此心肌梗死后，如何修復(fù)壞死心肌細(xì)胞一直是科研人員和臨床醫(yī)師面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。近年來(lái)干細(xì)胞移植治療為缺血性心肌病患者帶來(lái)新的曙光，目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells,BMMSCs)移植治療心肌梗死的研究已取得令人鼓舞的進(jìn)

3、展，但如何誘導(dǎo)BMMSCs獲得足夠數(shù)量的心肌樣細(xì)胞成為研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。隨著研究的深入，在不久的將來(lái)將逐步解決在心肌梗死后缺血性心肌病的BMMSCs移植治療過(guò)程中出現(xiàn)的各種問(wèn)題，并獲得顯著療效。
　　研究目的
　　1.探討大鼠BMMSCs體外分離、純化、傳代及鑒定方法。
　　2.觀察PFT-α對(duì)大鼠BMMSCs增殖和凋亡的影響及可能機(jī)制。
　　3.探索PFT-α對(duì)大鼠BMMSCs向心肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響路徑

4、及其可能機(jī)制。
　　研究方法
　　1.大鼠BMMSCs體外分離、純化及鑒定：采用頸椎脫臼法處死大鼠后分離下肢長(zhǎng)骨，將獲取的骨髓細(xì)胞通過(guò)密度梯度離心法聯(lián)合差速貼壁法去除BMMSCs中混雜的其他細(xì)胞，獲得純化的BMMSCs。倒置相差顯微鏡下觀察BMMSCs在培養(yǎng)傳代過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMSCs陽(yáng)性表面標(biāo)記抗原CD44和陰性標(biāo)記抗原CD45進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　2.PFT-α對(duì)大鼠BMMSCs增殖和凋亡

5、的影響：取第4代BMMSCs，采用MTT法檢測(cè)PFT-α的細(xì)胞毒性。同時(shí)進(jìn)行分組處理：空白對(duì)照組(CON)、5-AZA組(10μmol/L)、PFT-α組(20μmol/L)、5-AZA+PFT-α組(10μmol/L+20μmol/L)。MTT法檢測(cè)PFT-α對(duì)BMMSCs增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)PFT-α對(duì)BMMSCs凋亡的影響，WesternBlotting法檢測(cè)P53、P21蛋白的表達(dá)。
　　3.PFT-α誘導(dǎo)BMMSC

6、s分化為心肌樣細(xì)胞：取第4代BMMSCs進(jìn)行分組誘導(dǎo)，空白對(duì)照組(CON)、5-AZA組(10μmol/L)、PFT-α組(20μmol/L)、5-AZA+PFT-α組(10μmol/L+20μmol/L)。各組誘導(dǎo)24h后更換常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4w。顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，免疫熒光染色法鑒定各組BMMSCs誘導(dǎo)后1w、4w時(shí)心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和鏈接蛋白-43(CX-43)的表達(dá)；WesternBlotting法檢

7、測(cè)cTnI、P53、P21蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌樣細(xì)胞分化率。
　　研究結(jié)果
　　1.大鼠BMMSCs體外培養(yǎng)形態(tài)特征及鑒定：原代BMMSCs體積較小，形態(tài)多樣，大部分細(xì)胞為橢圓形、短梭形，7d后細(xì)胞體積增大，以長(zhǎng)梭形為主，形成細(xì)胞集落。傳代后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、旋渦狀生長(zhǎng)，且排列緊密、形態(tài)均一、趨向一致。流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMSCs表面標(biāo)志抗原CD44和CD45，結(jié)果顯示：CD44陽(yáng)性表達(dá)率為(89.98±1.29)％，C

8、D45陽(yáng)性表達(dá)率為(2.14±0.22)％。
　　2.PFT-α對(duì)大鼠BMMSCs增殖和凋亡的影響：MTT法檢測(cè)不同濃度PFT-α的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示：當(dāng)PFT-α濃度等于或者低于20μmol/L時(shí)，對(duì)BMMSCs的增殖有一定促進(jìn)作用，而當(dāng)其濃度達(dá)到40μmol/L時(shí)，PFT-α則可明顯抑制BMMSCs的增殖，當(dāng)濃度達(dá)到80μmol/L時(shí)，PFT-α顯著抑制BMMSCs細(xì)胞的增殖；MTT法檢測(cè)PFT-α對(duì)BMMSCs增殖的影響，結(jié)

9、果顯示：BMMSCs在處理后前3d，各組細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯差異，在第5d時(shí)，5-AZA組對(duì)BMMSCs增殖表現(xiàn)出明顯抑制，與CON組、PFT-α組及5-AZA+PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，在第7d時(shí)，也同樣表現(xiàn)出這樣的差異(P＜0.01)，并且PFT-α組和5-AZA+PFT-α組BMMSCs增殖明顯優(yōu)于空白對(duì)照組(P＜0.01)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組BMMSCs凋亡率，結(jié)果顯示：5-AZA組細(xì)胞凋亡率最高，與CON組

10、、PFT-α組及5-AZA+PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，其余3組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；Westernblotting法測(cè)定P53、P21蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：5-AZA組表達(dá)量明顯強(qiáng)于其余3組，與CON組、PFT-α組、5-AZA+PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)；而PFT-α組P53、P21蛋白表達(dá)量明顯減少，與CON組和5-AZA+PFT-α組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，CON組和

11、5-AZA+PFT-α組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.PFT-α誘導(dǎo)BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的鑒定：各組BMMSCs誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：除CON組外，各組細(xì)胞誘導(dǎo)約2w后，開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞體積及核增大，大部分細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)梭狀。誘導(dǎo)4w時(shí)鄰近細(xì)胞間連接較前緊密，并形成肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)；免疫熒光染色鑒定結(jié)果：誘導(dǎo)后1w時(shí)CON組未見(jiàn)cTnI和CX-43免疫熒光表達(dá)，其余3組均可見(jiàn)少量表達(dá)。誘導(dǎo)后4w時(shí)可見(jiàn)CON組少量表達(dá)cTn

12、I和CX-43，其余3組均強(qiáng)表達(dá)cTnI和CX-43，并可見(jiàn)肌管樣結(jié)構(gòu)；WesternBlotting檢測(cè)cTnI的表達(dá)，1w時(shí)CON組未見(jiàn)表達(dá)cTnI，其余3組均有少量表達(dá)。4w時(shí)，CON組可見(jiàn)少量表達(dá)，其余3組均有強(qiáng)表達(dá)。各組cTnI表達(dá)在4w時(shí)均明顯高于1w時(shí)的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌樣細(xì)胞的分化率，結(jié)果顯示：CON組分化率為(2.34±0.91)％，5-AZA組為(21.47±5.41)％，PFT-α組為(29.85±1.96)

13、％，5-AZA+PFT-α組為(30.97±5.74)％，5-AZA組、PFT-α組和5-AZA+PFT-α組與CON組比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，PFT-α組、5-AZA+PFT-α組與5-AZA組比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，PFT-α組和5-AZA+PFT-α組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；WesternBlotting檢測(cè)P53、P21蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：誘導(dǎo)1w時(shí)，5-AZA組P53、P21表達(dá)最強(qiáng)，

14、PFT-α組幾乎不表達(dá)，5-AZA組與其余3組比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，PFT-α和5-AZA+PFT-α組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。誘導(dǎo)4w時(shí)，5-AZA組仍強(qiáng)表達(dá)，其余3組表達(dá)較1w時(shí)有所增強(qiáng)，5-AZA組、PFT-α組、混合組與CON組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，5-AZA組與PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。PFT-α組、混合組組內(nèi)誘導(dǎo)4w時(shí)P53、P21表達(dá)量與1w時(shí)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

15、異(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論
　　1.采用密度梯度離心法聯(lián)合差速貼壁法能夠獲得純化的BMMSCs，通過(guò)觀察BMMSCs形態(tài)學(xué)特征和檢測(cè)BMMSCs陽(yáng)性標(biāo)記抗原CD44和陰性標(biāo)記抗原CD45，可以鑒定純化的BMMSCs。
　　2.PFT-α可以促進(jìn)BMMSCs的增殖，抑制BMMSCs的凋亡。當(dāng)PFT-α濃度≤20μmol/L時(shí)，對(duì)BMMSCs無(wú)毒性作用，能夠促進(jìn)BMMSCs增殖，抑制BMMSCs凋亡。當(dāng)濃度＞20μ