肝細(xì)胞核因子4α治療大鼠實(shí)驗(yàn)性肝硬化.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 肝硬化(liver cirrhosis)是肝纖維化發(fā)展的晚期階段。在其形成過(guò)程中,纖維化程度逐漸加深,在肝組織中形成以纖維包繞的異常肝細(xì)胞結(jié)節(jié)(假小葉)。目前研究已充分表明,肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的可逆的過(guò)程,也有研究認(rèn)為在人類和動(dòng)物模型中肝硬化可發(fā)生逆轉(zhuǎn),但其能否出現(xiàn)完全逆轉(zhuǎn)仍有較大爭(zhēng)議。
　　 肝細(xì)胞核因子4(hepatocyte nuclear factor,HNF4)是一種屬于細(xì)胞核激素受體

2、家族的轉(zhuǎn)錄因子,在分化成熟的肝細(xì)胞中高表達(dá)。其中HNF4α是HNF4重要亞型。HNF4α參與維護(hù)肝細(xì)胞白蛋白合成、藥物解毒、能量代謝、膽汁酸合成和脂肪代謝等重要功能,也是調(diào)控上皮細(xì)胞表型(如緊密連接、粘附連接、縫隙連接、橋粒以及細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間粘附分子、上皮細(xì)胞極性和細(xì)胞骨架蛋白等)表達(dá)的重要基因。
　　 本研究旨在探討HNF4α對(duì)大鼠肝硬化的治療效果及其機(jī)制。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]
　　 一、重組復(fù)制缺陷型腺病毒

3、AdHNF4α擴(kuò)增
　　 利用本實(shí)驗(yàn)室己構(gòu)建的表達(dá)HNF4α的重組腺病毒載體AdHNF4α,293細(xì)胞反復(fù)感染,擴(kuò)增高效表達(dá)HNF4α的AdHNF4α和空白對(duì)照病毒AdGFP,濃縮純化、測(cè)定滴度后保存。
　　 二、AdHNF4α治療實(shí)驗(yàn)性肝硬化
　　 將雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為4組,每組8只。第1組為正常對(duì)照組；第2～4組予硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)溶液按0.2

4、g/kg體重腹腔注射。每周注射3次,隔天1次,連續(xù)注射15w,制備TAA誘導(dǎo)的大鼠早期肝硬化模型。以同樣方式連續(xù)注射18周,制備TAA誘導(dǎo)的大鼠晚期肝硬化模型。
　　 模型制備完成后,第2組設(shè)為模型對(duì)照組,第3組設(shè)為病毒對(duì)照組,第4組設(shè)為AdHNF4α導(dǎo)入組。于TAA注射完畢后的三周內(nèi)分別經(jīng)尾靜脈注入5×109 pfu/只AdGFP或5×109 pfu/只 AdHNF4α,每周2次,共注射6次。
　　 末次注射病毒后2周

5、處死所有大鼠,分別觀察各組大鼠肝臟大體變化；HE、Masson’s trichrome和Sirius Red染色觀察病理變化,檢測(cè)ECM含量;堿水解法檢測(cè)各組肝組織羥脯氨酸含量；Real time PCR檢測(cè)肝臟Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)；Real timePCR檢測(cè)白蛋白(albumin,ALB)、谷胺酰氨合成酶(glutamine synthetase,GS)、細(xì)胞色素P450家族1A2(cytochrome P4501A2,CYP1A

6、2)肝細(xì)胞功能基因的表達(dá)；免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)HNF4α、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子αβ1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1(Fibroblast specific Protein-1,FSP1)等肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 三、AdHNF4α對(duì)肝細(xì)胞BRL-3A和HSC-T6生物學(xué)特性的影

7、響
　　 分別用AdGFP或AdHNF4α感染大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A(MOI=100)和大鼠肝活化星狀細(xì)胞株HSC-T6(MOI=1200),收集感染后72 h細(xì)胞,抽提總RNA及蛋白。Real time PCR和Western blot法檢測(cè)HNF4α表達(dá),同時(shí)測(cè)定Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原等肝纖維化相關(guān)基因的mRNA量。
　　 四、探討HNF4α治療實(shí)驗(yàn)性肝硬化機(jī)制
　　 (一)將病毒感染BRL-3A和HSC-T6

8、,Real time PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞HNF4α、肝纖維化相關(guān)基因、ERK通路相關(guān)基因、組織金屬蛋白酶抑制-1(tissueinhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)及基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrixmetalloproteinases,MMPs)表達(dá)變化。
　　 (二)Real time PCR檢測(cè)大鼠肝組織標(biāo)本中ERK通路相關(guān)基因MEK1、ERK1、ELK1和纖維

9、溶解系統(tǒng)基因TIMP-1、MMPs表達(dá)。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠肝組織標(biāo)本中HNF4α、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JunD、JunD、TIMP-1、MMP9、MMP13等蛋白的表達(dá)。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,結(jié)果以(X)±S表示。多組間采用One-WayANOVA分析,方差齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn);P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　

10、 一、HNF4α治療實(shí)驗(yàn)性大鼠肝硬化
　　 (一)成功建立TAA誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝硬化模型
　　 TAA注射15周后,大鼠肝臟硬度增加,表面呈顆粒狀或結(jié)節(jié)狀。病理檢查顯示,肝細(xì)胞變性、壞死,以小葉周邊更為顯著,匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生,肝內(nèi)廣泛假小葉形成,假小葉內(nèi)可見(jiàn)纖維再分隔現(xiàn)象,并伴有明顯的肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié),表明成功制備實(shí)驗(yàn)性早期肝硬化模型。TAA注射18周后,大鼠肝臟硬度增加,表面呈顆粒狀或結(jié)節(jié)狀,并且有大量

11、腹水形成,病理檢查顯示肝硬化程度加深,表明大鼠已進(jìn)入晚期肝硬化。
　　 (二)肝硬化形成過(guò)程中HNF4α表達(dá)逐漸下降
　　 Real time PCR和免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示,伴隨著肝硬化的發(fā)展,HNF4α的表達(dá)明顯下調(diào)；AdHNF4α導(dǎo)入后大鼠肝組織大量表達(dá)HNF4α(P<0.05)。
　　 (三)HNF4α逆轉(zhuǎn)大鼠早期肝硬化
　　 大鼠肝硬化形成早期(15周),通過(guò)尾靜脈注射AdHNF4α或AdGFP。

12、AdHNF4α治療組大鼠肝臟質(zhì)地柔軟,表面較光滑。HE、Masson和Sirius Red染色顯示HNF4α治療組大鼠肝臟硬化程度明顯減輕,假小葉結(jié)構(gòu)消失,提示HNF4α可逆轉(zhuǎn)早期肝硬化。模型對(duì)照組和AdGFP組羥脯氨酸含量分別為327.37±27.43μg/g和338.1±39.57μg/g,相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；AdHNF4α治療組羥脯氨酸含量為252.65±19.93μg/g,較上述兩個(gè)對(duì)照組明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

13、義(P<0.05)。分析軟件結(jié)果顯示,AdHNF4α組膠原染色面積約為AdGFP組的32％(P<0.05)。Real time PCR檢測(cè)提示AdHNF4α治療組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原較AdGFP組表達(dá)降低(P<0.05)。
　　 (四)HNF4α保護(hù)大鼠肝功能
　　 血清生化檢測(cè)顯示,AdHNF4α治療后ALT、AST分別為59.3±2.52U/L、142±7U/L,與AdGFP組(71±4.58 U/L、176.3±7.

14、5U/L)比較明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Real time PCR結(jié)果顯示,AdHNF4α治療后肝組織肝功能相關(guān)基因ALB、GS和CYP1A2表達(dá)較AdGFP對(duì)照組升高(P<0.05)。
　　 (五)HNF4α抑制大鼠肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)
　　 免疫組織化學(xué)檢測(cè)提示,AdHNF4α治療組肝纖維化相關(guān)基因:α-SMA、FSP1和TGF-β1表達(dá)較AdGFP對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。
　　

15、(六)HNF4α減輕晚期肝硬化大鼠肝纖維化
　　 大鼠肝硬化形成晚期(18周),通過(guò)尾靜脈注射AdHNF4α或AdGFP。AdHNF4α治療組大鼠肝臟表面仍然呈顆粒狀或結(jié)節(jié)狀。HE、Masson和Sirius Red染色顯示HNF4α治療組大鼠肝臟纖維化程度較AdGFP對(duì)照組減輕(P<0.05)。但病理檢查顯示,肝內(nèi)仍存在假小葉。提示HNF4α僅可減輕晚期肝硬化纖維化程度,而不能逆轉(zhuǎn)其肝硬化。
　　 二、HNF4α抑制E

16、RK通路的活性
　　 (一)HNF4α抑制大鼠肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞株ERK通路活性
　　 AdHNF4α感染肝細(xì)胞株BRL-3A和HSC-T6細(xì)胞72 h后,Real time PCR檢測(cè)顯示,AdHNF4α治療組ERK1以及其下游基因ELK1表達(dá)較AdGFP對(duì)照組明顯降低(P<0.05),而ERK1上游基因MER1表達(dá)呈負(fù)反饋性上調(diào)(P<0.05)。Western blot法發(fā)現(xiàn),AdHNF4α治療組HSC-T6細(xì)胞p-

17、ERK、p-JunD表達(dá)較AdGFP對(duì)照組明顯降低,而ERK1/2、JunD的表達(dá)較對(duì)照組未見(jiàn)明顯差異。
　　 (二)HNF4α抑制實(shí)驗(yàn)性肝硬化大鼠肝臟ERK通路活性
　　 Real time PCR檢測(cè)顯示,AdHNF4α組肝組織ERK1及其下游基因ELK1表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(P<0.05),ERK1上游基因MER1表達(dá)略增加(P<0.05)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)提示AdHNF4α治療組肝臟p-ERK、ERK1/2及其調(diào)

18、控的p-JunD、JunD表達(dá)較AdGFP對(duì)照組明顯減少。
　　 三、HNF4α調(diào)節(jié)纖維溶解系統(tǒng)的平衡
　　 (一)HNF4α調(diào)節(jié)大鼠肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞株TIMP-1、MMPs的表達(dá)
　　 AdHNF4α感染BRL-3A、HSC-T6細(xì)胞72 h后,Real time PCR檢測(cè)顯示TIMP-1表達(dá)較AdGFP對(duì)照組明顯降低(P<0.05),MMP2、MMP9和MMP13的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。Western

19、 blot法結(jié)果顯示AdHNF4α治療組HSC-T6細(xì)胞TIMP-1表達(dá)較AdGFP對(duì)照組明顯降低。AdHNF4α作用停止后,HSC—T6的TIMP-1表達(dá)隨之升高。
　　 (二)HNF4α調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性肝硬化大鼠肝臟TIMP-1、MMPs表達(dá)
　　 Real time PCR檢測(cè)顯示AdHNF4α治療組TIMP-1表達(dá)較AdGFP對(duì)照組明顯降低(P<0.05),MMP2的表達(dá)略升高(P<0.05),而MMP9、MMP13的

20、表達(dá)較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫組織化學(xué)檢測(cè)提示,伴隨肝硬化逆轉(zhuǎn),成纖維細(xì)胞減少,AdHNF4α治療組TIMP-1表達(dá)較AdGFP對(duì)照組降低,MMP2、MMP9和MMP13分泌較AdGFP對(duì)照組減少。
　　 [結(jié)論]
　　 一、肝硬化進(jìn)程中,肝細(xì)胞HNF4α表達(dá)逐漸降低。
　　 二、AdHNF4α體內(nèi)導(dǎo)入可逆轉(zhuǎn)早期肝硬化,促進(jìn)肝功能恢復(fù),是治療實(shí)驗(yàn)性肝硬化新的有效方法。但是不能完全逆轉(zhuǎn)晚期肝硬化。
　　 三