缺氧誘導(dǎo)因子1α對失血性休克血管舒張反應(yīng)性的調(diào)控作用及與肌內(nèi)皮縫隙連接蛋白的關(guān)系.pdf

1、嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克失代償期常出現(xiàn)血管的低反應(yīng)性,它表現(xiàn)為全身血管對縮血管物質(zhì)和舒血管物質(zhì)的反應(yīng)降低或不反應(yīng),導(dǎo)致血壓不能有效提升、組織灌注難以改善,細(xì)胞缺氧和損傷進(jìn)行性加重。研究發(fā)現(xiàn)血管低反應(yīng)性的發(fā)生與腎上腺素能受體失敏、一氧化氮(nitric oxide,NO)水平增高、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)鉀、鈣通道功能失常及細(xì)胞膜超極化有關(guān)。此外,本實驗室的前期研究也發(fā)現(xiàn):休克后,VSMC存

2、在鈣失敏,VSMC鈣失敏在休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生中起重要作用。
　　 HIF-1α是缺氧誘導(dǎo)因子家族優(yōu)勢亞型HIF-1的活性亞基。通過與其調(diào)控基因的增加子序列結(jié)合,HIF-1廣泛參與了哺乳動物細(xì)胞對低氧的特異性應(yīng)答,在缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起到了關(guān)鍵性的作用,其下游調(diào)節(jié)基因作用包括紅細(xì)胞生成、細(xì)胞能量代謝、離子代謝、血管舒縮反應(yīng)、血管生成、細(xì)胞周期調(diào)控等。
　　 本實驗室前期研究證實,在失血性休克后,HIF-1α在血

3、管收縮反應(yīng)性的調(diào)節(jié)中有重要的作用,其機制是:HIF-1α通過調(diào)控eNOS、iNOS、HO-1、COX-2、ET-1等下游的基因,調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)釋放而調(diào)節(jié)血管收縮反應(yīng)性。但HIF-1α是否參與休克后血管舒張反應(yīng)性的調(diào)節(jié),其調(diào)節(jié)機制如何,是否與MEGJ有關(guān)國內(nèi)外尚未見報道,需要研究闡明。
　　 為此,本實驗利用SD大鼠失血性休克模型和離體缺氧培養(yǎng)血管環(huán),研究了HIF-1α對失血性休克后血管舒張反應(yīng)性的調(diào)控作用以及與MEGJ的關(guān)系。

4、具體內(nèi)容包括:(1)HIF-1α對失血性休克血管舒張反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用:(2)HIF-1α對缺血缺氧血管舒張反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用與MEGJ的關(guān)系;(3)HIF-1α對失血性休克血管鈣敏感性的調(diào)節(jié)作用。
　　 主要實驗方法:
　　 第一部分 HIF-1α對失血性休克血管舒張反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用
　　 實驗以失血性休克SD大鼠腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA)為研究對象,觀察HIF-1

5、α特異性抑制劑寡霉素(oligomycin)處理前后,休克大鼠SMA(休克即刻,休克0.5h,休克1h,休克2h,休克3h,休克4h)對非內(nèi)皮依賴的血管舒張劑硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)和內(nèi)皮依賴的舒張劑乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)的反應(yīng)性變化情況。同時測定不同程度休克血管中HIF-1α mRNA的表達(dá)變化。
　　 第二部分 HIF-1α對缺血缺氧血管舒張反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用與MEGJ

6、的關(guān)系
　　 實驗取正常大鼠SMA血管環(huán),通過缺氧和營養(yǎng)剝奪培養(yǎng)模擬失血性休克體內(nèi)缺血缺氧環(huán)境(缺氧即刻,缺氧0.5h,缺氧1h,缺氧2h,缺氧3h,缺氧4h),觀察寡霉素處理前后缺血缺氧處理血管環(huán)對Ach的舒張反應(yīng)性變化規(guī)律;觀察使用反義寡核苷酸阻斷MEGJ后的血管環(huán)對Ach的舒張反應(yīng)性變化規(guī)律。分別使用銀杏葉提取物EGb761(商品名:金納多)和寡霉素誘導(dǎo)和阻斷HIF-1α的表達(dá),測定Cx40、Cx43 mRNA的表達(dá)變化。

7、用免疫共沉淀技術(shù)檢測HIF-1α與Cx40、Cx43有無直接結(jié)合活性。
　　 第三部分 HIF-1α對失血性休克血管鈣敏感性的調(diào)節(jié)作用
　　 實驗以失血性休克SD大鼠腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA)為研究對象,觀察HIF-1α特異性抑制劑寡霉素(oligomycin)處理前后,休克大鼠SMA(休克即刻,休克0.5h,休克1h,休克2h,休克3h,休克4h)的鈣敏感性變化情況。同

8、時測定不同程度休克血管中MLC20磷酸化水平的變化情況。
　　 主要研究成果:
　　 1.HIF-1α對失血性休克血管舒張反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用
　　 各休克組SMA血管環(huán)對低濃度SNP(10-9、10-8、10-7 mol/L)的舒張反應(yīng)性降低;寡霉素可進(jìn)一步降低其最大舒張反應(yīng)。休克后血管對Ach的舒張反應(yīng)性呈下降-上升-再下降的趨勢,即在休克即刻有一短暫降低,隨后呈代償性增加,休克2小時達(dá)峰值,2小時后呈下降趨勢;

9、使用寡霉素后,血管對Ach的舒張反應(yīng)性在休克早期(休克即時-休克1小時)顯著下降,而在休克晚期(休克2小時-休克4小時)呈上升趨勢。與正常組相比,休克后HIF-1α mRNA的表達(dá)增加;與休克早期的內(nèi)皮依賴的舒張反應(yīng)呈正相關(guān),而與休克晚期的呈負(fù)相關(guān),與內(nèi)皮非依賴的舒張反應(yīng)性沒有相關(guān)性。結(jié)果說明:HIF-1α對于非內(nèi)皮依賴的血管舒張反應(yīng)性僅在休克早期存在正性調(diào)節(jié)作用,對內(nèi)皮依賴的血管舒張反應(yīng)性,在休克早期呈正性調(diào)節(jié)作用,而在休克晚期呈負(fù)向

10、調(diào)節(jié)。
　　 2.HIF-1α對缺血缺氧血管舒張反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用與MEGJ的關(guān)系
　　 (1)HIF-1α對缺血缺氧血管舒張反應(yīng)性的調(diào)控作用:經(jīng)過體外缺血缺氧處理的大鼠SMA血管環(huán)與失血性休克后血管環(huán)對Ach的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)性具有相似的變化趨勢,即SMA血管環(huán)對Ach的舒張反應(yīng)性呈先下降,后上升,再下降的趨勢。缺氧處理SMA血管環(huán)的最大舒張反應(yīng)在缺氧1h時達(dá)到最大,其后逐步下降,以缺氧4h最差。與缺氧對照組比較,寡霉

11、素使SMA血管環(huán)最大舒張反應(yīng)在休克早期下降,而在休克后期上升。寡霉素處理即刻組顯著差于缺氧對照組,而3h和4h的寡霉素處理組最大舒張反應(yīng)均高于缺氧對照組。結(jié)果說明:HIF-1α對體外缺血缺氧處理大鼠SMA血管舒張反應(yīng)性與休克處理在體內(nèi)具有同樣的調(diào)節(jié)作用,即對內(nèi)皮依賴性的血管舒張反應(yīng)性在缺血缺氧早期存在正性調(diào)節(jié)作用,而在缺血缺氧晚期存在負(fù)向調(diào)節(jié)。
　　 (2)Cx40和Cx43對缺血缺氧血管舒張反應(yīng)性的調(diào)控作用:Cx40AODN和

12、Cx43AODN轉(zhuǎn)染后,SMA血管組織Cx40和Cx43 mRNA表達(dá)明顯下降。缺氧處理使SMA血管環(huán)對Ach的內(nèi)皮舒張反應(yīng)性下降。使用Cx40 AODN阻斷Cx40表達(dá)后,缺氧處理SMA血管環(huán)在缺氧4h對Ach的舒張反應(yīng)性顯著高于空白對照組,而與正常組和缺氧1h組無差異。使用Cx43 AODN后,血管環(huán)的舒張反應(yīng)性在未進(jìn)行缺氧處理時顯著下降,而缺氧處理后與空白對照組無差異。結(jié)果說明:MEGJ Cx40和Cx43參與了休克后血管舒張反應(yīng)

13、性的調(diào)節(jié),Cx40降低休克晚期血管舒張反應(yīng)性,Cx43升高休克早期血管舒張反應(yīng)性。
　　 (3)HIF-1α調(diào)節(jié)血管舒張反應(yīng)性與Cx40和Cx43的關(guān)系:使用銀杏葉提取物EGb761后,HIF-1α mRNA的表達(dá)增高,與空白對照組相比,以正常組和缺氧4h組的增加較為明顯。使用EGb761后,各組Cx40 mRNA表達(dá)均較空白對照組顯著提高;而寡霉素使正常組和缺氧4h組Cx40 mRNA表達(dá)顯著下降。與空白對照組相比,EGb76

14、1使Cx43 mRNA的表達(dá)不同程度下降,以正常組和缺氧1h組較為明顯;而寡霉素使缺氧4h組Cx43 mRNA表達(dá)較空白對照組顯著升高。HIF-1α的免疫沉淀可以雜交出各組的Cx43條帶,而只能雜交出正常對照組和缺氧1h組微弱的Cx40條帶。結(jié)果說明:HIF-1α可通過上調(diào)Cx40的表達(dá)和下調(diào)Cx43的表達(dá)調(diào)節(jié)血管舒張反應(yīng)性的變化;HIF-1α與Cx40、Cx43可能存在直接的結(jié)合作用,對Cx43的作用較強,對Cx40的作用相對較弱,其

15、具體結(jié)合特性及有無直接作用尚需進(jìn)一步研究確認(rèn)。
　　 3.HIF-1α對失血性休克鈣敏感性的調(diào)節(jié)作用
　　 失血性休克后,SMA血管環(huán)鈣敏感性呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。血管對鈣濃度的量一效曲線在休克0.5 h明顯左移,Emax顯著增加。在休克2h至4h,血管環(huán)對Ca2+敏感性明顯下降,Ca2+的量效曲線明顯右移,Emax顯著降低。使用寡霉素后,SMA血管環(huán)對鈣濃度的量-效曲線均右移,以休克1h和休克2h組較為顯著。寡霉素降低

16、了休克早期的鈣敏感性,并使其在休克后期上升;其中,以休克0.5h組和休克1h組下降較為明顯。休克后,MLC20磷酸化水平出現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢。與正常組相比,休克即刻升高明顯;隨休克時相延長逐步下降,休克3h組和休克4h組明顯低于正常組。使用寡霉素抑制HIF-1α后,MLC20磷酸化水平?jīng)]有出現(xiàn)先升高后下降的趨勢,各組間均無顯著差異。而與休克組相比,寡霉素處理組在休克即刻的高磷酸化水平受到顯著抑制,而休克3h組和休克4h組的磷酸化水

17、平顯著升高。結(jié)果說明:HIF-1α參與了失血性休克后血管鈣敏感性的調(diào)節(jié),在休克早期有正性調(diào)節(jié)作用,而在休克晚期呈負(fù)向調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)論:
　　 1.HIF-1α參與了失血性休克后血管舒張反應(yīng)性的調(diào)節(jié)。對于非內(nèi)皮依賴的血管舒張反應(yīng)性僅在休克早期存在正性調(diào)節(jié)作用;對內(nèi)皮依賴的血管舒張反應(yīng)性,在休克早期存在正性調(diào)節(jié)作用,而在休克晚期存在負(fù)向調(diào)節(jié)作用。
　　 2.MEGJ Cx40可能參與了休克晚期血管舒張反應(yīng)的下降,C