MiR-146b在間質(zhì)干細胞介導(dǎo)的順鉑腎損傷保護中的作用機制研究.pdf

1、目的：前期研究結(jié)果顯示大鼠骨髓間質(zhì)干細胞(rat bone marrow mesenchymal stemcell，rMSC)能對順鉑誘導(dǎo)的腎損傷起到保護作用，本研究進一步探討miR-146b在其中的作用及機制，評價miR-146b為急性腎損傷早期分子標(biāo)志物的可能性。通過沉默miR-146b表達比較觀察順鉑損傷條件下腎小管上皮(NRK-52E)細胞的生物學(xué)特性改變，闡明miR-146b調(diào)控的關(guān)鍵靶基因及相關(guān)下游通路，揭示miR-146b

2、參與MSC對順鉑誘導(dǎo)的腎毒性保護作用的可能分子機制。
　　方法：體外實驗研究分三組，正常組為常規(guī)培養(yǎng)的NRK-52E細胞，損傷組以7.5μM順鉑處理NRK-52E細胞6h后常規(guī)培養(yǎng)48h，rMSC組是在順鉑損傷后與rMSC共培養(yǎng)48h的細胞。PCNA免疫組織化學(xué)染色檢測各組細胞增殖能力的差異，TUNEL檢測細胞凋亡，Western Blot對比分析增殖凋亡相關(guān)蛋白的表達，綜合判斷rMSC對損傷的NRK-52E細胞的保護作用，通過熒

3、光定量RT-PCR檢測了各組細胞中miR-146b表達差異。以亂序序列為陰性對照(negative control，N.C.)，順鉑損傷后的NRK-52E細胞轉(zhuǎn)染miR-146b抑制劑(inhibitor)，通過生長曲線、平板克隆形成實驗及PCNA免疫組織化學(xué)染色檢測細胞增殖能力，TUNEL-FITC比較細胞凋亡。利用TargetScan預(yù)測miR-146b靶基因，熒光素酶報告基因驗證miR-146b對野生型預(yù)測靶基因erbB43'非編

4、碼區(qū)(3'UTR)特異性靶向作用。Western Blot檢測N.C.和inhibitor組NRK-52E細胞中增殖凋亡相關(guān)蛋白、erbB4及其下游蛋白的表達。RT-PCR驗證erbB4 siRNAs對其在mRNA水平的抑制作用，Westem Blot觀察siRNAs對erbB4下游相關(guān)通路蛋白的影響。
　　體內(nèi)實驗以3mg/kg的順鉑劑量注射到大鼠腹腔，構(gòu)建低劑量順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型。在順鉑注射后1-5d每天收集大鼠血清及腎

5、臟標(biāo)本，檢測血清肌酐(Cr)、尿素(BU)及組織切片HE染色以評價腎功能，熒光定量RT-PCR檢測血清及腎組織中miR-146b表達情況。Taq-man熒光定量RT-PCR檢測hs-miR-146b-5p（miR-146b的人類同源性分子）在臨床腎病患者及健康人血清中的差異表達。
　　結(jié)果：體外研究結(jié)果顯示，rMSC能逆轉(zhuǎn)損傷的NRK-52E細胞PCNA減弱趨勢，并減輕受損NRK-52E細胞凋亡。順鉑使NRK-52E細胞內(nèi)miR-

6、146b表達上升(P＜0.001)，而在與rMSC共培養(yǎng)后又下調(diào)（P＜0.01）。MiR-146b inhibitor能有效減少損傷后NRK-52E細胞中miR-146b表達，生長曲線分析、平板克隆形成實驗均顯示miR-146b表達抑制后能促進順鉑損傷后的NRK-52E細胞增殖，與PCNA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致。結(jié)合文獻報道，通過TargetScan預(yù)測miR-146b的靶基因中篩選獲得erbB4。雙熒光素酶報告基因分析驗證了erbB

7、4是miR-146b的直接靶基因。Western Blot結(jié)果表明miR-146b表達抑制的NRK-52E細胞中erbB4、PCNA及Bcl-2表達增高，同時erbB4下游蛋白raf1/2和erk1/2也發(fā)生上調(diào)。RT-PCR證明siRNA能有效抑制erbB4在mRNA水平的表達，Westem Blot顯示erbB4 siRNA2轉(zhuǎn)染的細胞中，erbB4直接下游蛋白stat5及mek/erk/c-myc表達均減弱。體內(nèi)實驗中，血清Cr及

8、BU水平檢測及腎組織切片HE染色結(jié)果表明，低劑量順鉑能誘導(dǎo)急性腎損傷。相較于Cr與BU，血清中的miR-146b能在順鉑處理1d時即有顯著性高表達（P＜0.05）。臨床腎病患者血清中hs-miR-146b-5p較健康人表達水平較高（P＜0.01）。
　　結(jié)論：體內(nèi)外實驗揭示順鉑誘導(dǎo)腎損傷過程中miR-146b表達上調(diào)，miR-146b可作為腎損傷的早期分子標(biāo)志物。MiR-146b通過抑制erbB4及其下游通路蛋白從而抑制損傷的NR