亞甲基四氫葉酸還原酶C677T和內(nèi)皮胞蛋白C受體A6936G基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景:
　　 深靜脈血栓形成(DVT)是指血液在深靜脈內(nèi)不正常凝結(jié)，阻塞管腔，導(dǎo)致靜脈回流障礙的一種疾病。深靜脈血栓形成的主要癥狀為肢體腫脹和疼痛，癥狀隨著血栓的蔓延可能會(huì)逐漸加重，少數(shù)嚴(yán)重病例可以發(fā)生股青腫甚至靜脈性壞疽。而且如果不能及時(shí)妥當(dāng)?shù)卦\斷和處理，有些癥狀會(huì)長(zhǎng)期遷延，最終會(huì)演變?yōu)殪o脈血栓形成后綜合征，長(zhǎng)期影響患者的生活質(zhì)量;還有一些病人可能會(huì)因血栓脫落而形成肺栓塞，直接危及病人生命，或者演變?yōu)槁运ㄈ苑蝿?dòng)脈高壓。

2、目前，我國(guó)DVT的發(fā)病率尚無(wú)確切的統(tǒng)計(jì)資料，據(jù)國(guó)外資料報(bào)道，美國(guó)DVT年發(fā)病率約為千分之一。
　　 一個(gè)半世紀(jì)以前，Rudolph Virchow提出了血液瘀滯，血管壁的變化和血液高凝狀態(tài)是機(jī)體發(fā)生發(fā)展靜脈血栓的主要機(jī)制，這個(gè)理論現(xiàn)今仍然適用，基本上所有的導(dǎo)致血栓的因素，都影響這三種機(jī)制之一。目前認(rèn)為有很多導(dǎo)致個(gè)體易患靜脈血栓的因素，可分為兩類:一種是環(huán)境及后天生理病理因素的改變，如外傷，妊娠，圍手術(shù)期，惡性腫瘤，機(jī)體制動(dòng)，藥物

3、等影響機(jī)體的凝血機(jī)制;另一種是由遺傳基因突變參與的凝血機(jī)制異常，有研究認(rèn)為遺傳基因突變?cè)诖笥?0％的個(gè)體參與到了深靜脈血栓的發(fā)生過(guò)程。人們對(duì)各種基因多態(tài)性與血栓形成之間的關(guān)聯(lián)性做了相當(dāng)深入的研究，也發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的基因多態(tài)現(xiàn)象確實(shí)參與到了凝血機(jī)制的改變和調(diào)節(jié)，并與靜脈血栓構(gòu)成相關(guān)性。目前有研究認(rèn)為亞甲基四氫葉酸還原酶C677T基因多態(tài)性由于會(huì)導(dǎo)致亞甲基四氫葉酸還原酶活性下降，進(jìn)而影響同型半胱氨酸代謝，形成高同型半胱氨酸血癥，從而促進(jìn)血液

4、高凝，增加機(jī)體血栓形成的風(fēng)險(xiǎn);內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體A6936G基因多態(tài)性由于會(huì)提高血漿sEPCR的水平，進(jìn)而增大sEPCR對(duì)蛋白C抗凝途徑的負(fù)向調(diào)節(jié)，從而形血液高凝，增加機(jī)體血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)這兩類基因多態(tài)現(xiàn)象的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，本課題以臨床病例為基礎(chǔ)，采用一定的試驗(yàn)方法，對(duì)亞甲基四氫葉酸還原酶C677T基因多態(tài)性和內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體A6936G基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成的相關(guān)性進(jìn)行了研究。
　　 第一部分亞甲基四氫葉酸還原酶C6

5、77T基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成的相關(guān)性研究
　　 亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)在同型半胱氨酸(Hcy)代謝中起著關(guān)鍵作用，可以催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)換為5-甲基四氫葉酸，從而成為甲基的提供者參與維生素B12依賴的同型半胱氨酸向蛋氨酸轉(zhuǎn)化;MTHFR活性降低，會(huì)導(dǎo)致Hcy的代謝障礙，進(jìn)而形高同型半胱氨酸血癥。最近的研究已經(jīng)證實(shí)高血漿Hcy濃度是在深靜脈血栓形成的危險(xiǎn)因素之一，而MTHFR C677T基因多態(tài)性已被報(bào)

6、道可能會(huì)產(chǎn)生MTHFR酶的熱不穩(wěn)定性以及一定程度上降低該酶的活性，進(jìn)而形成高同型半胱氨酸血癥，從而導(dǎo)致機(jī)體易形成血栓。為了進(jìn)一步深入研究探討這一理論，我們?cè)O(shè)計(jì)了本項(xiàng)病例對(duì)照研究。
　　 目的與方法:
　　 探討血Hcy水平及MTHFR C677T基因多態(tài)性與DVT發(fā)病的關(guān)系。在本課題的病例對(duì)照研究中，我們分析了DVT患者的MTHFR基因C677T多態(tài)性各基因型的頻率，并與正常對(duì)照進(jìn)行比較。此外，通過(guò)檢測(cè)受試者血漿Hcy水

7、平，我們?cè)u(píng)估這一多態(tài)性與血漿Hcy水平之間的關(guān)聯(lián)，以及血漿Hcy水平與DVT的關(guān)系。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血漿Hcy水平，采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)測(cè)定基因組DNA。
　　 結(jié)果:
　　 MTHFR基因在677位置共有3種基因型，CC，CT和TT基因型，T為突變等位基因。在DVT組，T等位基因頻率明顯高于對(duì)照組。與CC基因型相比，TT基因型與DVT相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加(OR

8、=3.200;95％CI，1.293-7.922，P=0.010)。與等位基因C相比，突變等位基因T與DVT的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)(OR=1.712;95％CI，1.095-2.675，P=0.018)，DVT組的血漿Hcy水平顯著高于對(duì)照組，而且MTHFR基因C677T突變對(duì)于血漿Hcy水平有影響，突變等位基因T與血漿Hcy水平升高有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 MTHFR677位點(diǎn)基因突變與個(gè)體發(fā)生DVT的風(fēng)險(xiǎn)增加之間存在關(guān)聯(lián)。

9、突變純合子可以導(dǎo)致DVT風(fēng)險(xiǎn)增加，突變等位基因T也與DVT風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。DVT患者有著比健康人群更高的血漿同型半胱氨酸水平，而且MTHFR基因C677T突變對(duì)于血漿Hcy水平有影響，突變等位基因T與血漿Hcy水平升高有關(guān)。結(jié)論是，MTHFR C677T基因多態(tài)性可能是DVT發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一，而這種關(guān)聯(lián)可能是通過(guò)血漿Hcy的濃度變化實(shí)現(xiàn)的。
　　 第二部分內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體A6936G基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成的相關(guān)性研究

10、>　　 已知蛋白C(PC)系統(tǒng)是一種重要的抗凝血機(jī)制，在其輔酶蛋白S(PS)存在的條件下，活化蛋白C(aPC)使因子Va和Ⅷa失活，從而減少凝血酶生成。內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)，是一種在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面的受體。這種受體可以與PC或aPC結(jié)合。這種結(jié)合可以提高PC的活化效率，加速aPC對(duì)因子Va和Ⅷa滅活，從而實(shí)現(xiàn)抗凝。而可溶性內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(sEPCR)在金屬蛋白酶作用下從EPCR脫落，也可以與PC和aPC結(jié)合，但它與EP

11、CR作用相反，而且產(chǎn)生了與EPCR的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，從而抑制了aPC的抗凝活性，導(dǎo)致高凝。因此血漿sEPCR水平被認(rèn)為與機(jī)體的高凝傾向有關(guān)，sEPCR水平升高會(huì)導(dǎo)致機(jī)體易患血栓，而EPCR基因突變可能會(huì)產(chǎn)生sEPCR水平的升高。為了進(jìn)一步探討這個(gè)理論，我們對(duì)EPCR A6936G多態(tài)性、血漿sEPCR水平和DVT之間的關(guān)系進(jìn)行了深入的研究。
　　 目的與方法:
　　 本研究通過(guò)檢測(cè)DVT病人以及正常對(duì)照人群EPCR A693

12、6G多態(tài)性分布，并通過(guò)測(cè)定血漿sEPCR表達(dá)水平，探討其在DVT形成中的作用。病例組由已確診的DVT患者組成，對(duì)照組來(lái)自健康查體者。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血漿sEPCR水平，采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)測(cè)定基因組DNA。
　　 結(jié)果:
　　 DVT組突變等位基因G的頻率顯著高于對(duì)照組。相對(duì)于AA基因型，AG基因型(OR=2.502;95％CI，1.215-5.153)，和等

13、位基因G攜帶者AG+GG(OR=2.507;95％CI，1.238-5.076)，都表現(xiàn)出增加了DVT的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。突變等位基因G，相對(duì)于等位基因A，也增加了DVT發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.178;95％CI，1.159-4.093)。DVT組血漿sEPCR水平顯著高于對(duì)照組，而突變等位基因G與血漿sEPCR水平升高有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 EPCR6936的基因突變與機(jī)體DVT發(fā)病的敏感性有關(guān)，突變等位基因G導(dǎo)致DVT發(fā)病

14、危險(xiǎn)增加。DVT患者具有比健康群體更高的血漿sEPCR水平，而且血漿sEPCR水平與EPCR A6936G基因多態(tài)性存在關(guān)聯(lián)，基因突變會(huì)導(dǎo)致血漿sEPCR水平升高。結(jié)論是，EPCR A6936G的基因多態(tài)性與血漿sEPCR水平升高有關(guān)，其可能是人群中發(fā)生DVT的危險(xiǎn)因素之一。
　　 課題創(chuàng)新性與意義
　　 一.本研究結(jié)合了流行病學(xué)的研究方法和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，首次同期聯(lián)合檢測(cè)了DVT患者和健康人群的MTHFR基因C6

15、77T和EPCR基因A6936G多態(tài)性的分布以及與其關(guān)聯(lián)的功能蛋白Hcy和sEPCR的表達(dá)水平，確定兩個(gè)基因多態(tài)性與DVT之間的聯(lián)系，以及基因多態(tài)性與功能蛋白表達(dá)水平的關(guān)系。為從病因?qū)W上在基因水平研究血栓性疾病增加了新的認(rèn)識(shí)。
　　 二.本課題體現(xiàn)了“基因-蛋白-疾病”的研究思路，由于本研究對(duì)象集中于特定的地理區(qū)域（山東），實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的地域代表性，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)論也具有臨床指導(dǎo)意義;此外，本研究從方法學(xué)上為進(jìn)一步研究基因多態(tài)性