β-葡聚糖增強大鼠乳腺上皮細胞的自主防御及其機制研究.pdf

1、本實驗選用健康SD大鼠，旨在利用LPS誘發(fā)實驗性大鼠乳腺炎模型，研究β-葡聚糖對大鼠乳腺防御機能的影響和保護效應(yīng);在此基礎(chǔ)上，揭示大鼠乳腺上皮細胞對LPS作用的自主防御反應(yīng)，并深入研究和闡明β-葡聚糖增強大鼠乳腺上皮細胞自主防御的作用以及機制。結(jié)果如下:
　　 1β-葡聚糖通過激活Dectin1對人工誘導(dǎo)實驗性乳腺炎大鼠的保護利用LPS誘導(dǎo)的實驗性乳腺炎大鼠模型研究β-葡聚糖對動物乳腺的保護。自懷孕第10天起，實驗組大鼠灌喂生理

2、鹽水（陽性對照組，PC，n=8）、0.1 mg/kg·dβ-葡聚糖（低劑量組，PL，n=8）、1 mg/kg·dβ-葡聚糖（中劑量組，PM，n=8）、10 mg/kg·dβ-葡聚糖（高劑量組，PH，n=8），對照組大鼠灌喂生理鹽水（陰性對照組，NC，n=8），連續(xù)灌喂10天。產(chǎn)后72 h分別灌注滅菌生理鹽水至對照組和10μg/側(cè)LPS到實驗組大鼠第四對乳腺（兩側(cè)）內(nèi)，12 h后處死大鼠，采集乳腺組織和血清用于相關(guān)指標的測定和分析。結(jié)果表

3、明:LPS能顯著增加大鼠乳腺Dectin1(P＜0.05)和TLR4(P＜0.05)的mRNA和蛋白的表達水平;顯著增加大鼠乳腺及血清中腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosisfactor-α，TNF-α)(P＜0.05)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)(P＜0.05)的濃度，N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase)(P＜0.05)、誘

4、導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOs)(P＜0.05)及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)(P＜0.05)的活性。與陽性對照組相比，灌喂β-葡聚糖能顯著增強Dectin1的mRNA和蛋白的表達，降低TLR4的mRNA和蛋白的表達;降低大鼠乳腺及血清中TNF-α、IL-1β的濃度，大鼠乳腺NAGase、iNOs、MPO的活性，但能提高大鼠血清中白細胞介素-2(IL

5、-2)的濃度。形態(tài)學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖處理組的乳腺腺泡內(nèi)僅見少量的PMN浸潤，且乳腺的泌乳功能得以恢復(fù)。結(jié)果顯示，β-葡聚糖能通過激活Dectin1受體最終產(chǎn)生對實驗性乳腺炎大鼠的保護效應(yīng)。
　　 2大鼠乳腺上皮細胞對LPS的自主防御反應(yīng)與β-葡聚糖的保護效應(yīng)研究利用LPS與原代培養(yǎng)的大鼠乳腺上皮細胞共孵育研究乳腺上皮細胞的自主防御反應(yīng)和β-葡聚糖產(chǎn)生的保護效應(yīng)。設(shè)置實驗組為陽性對照組(PC，等量DMSO，n=5)、低劑量組

6、(PL，1μg/mLβ-葡聚糖，n=5)、中劑量組(PM，5μg/mLβ-葡聚糖， n=5)、高劑量組(PH，25μg/mLβ-葡聚糖，n=5)以及陰性對照組（NC，等量DMSO，n=5），處理細胞12h。更換無血清培養(yǎng)液，10μg/mL LPS處理實驗組細胞40min，收集細胞及細胞液。與陰性對照組相比，LPS能顯著提高CD14(P＜0.05)、MD2(P＜0.05)的mRNA表達;顯著提高TLR4(P＜0.05)的mRNA和蛋白表達

7、;顯著提高MyD88(P＜0.05)、Dectin1(P＜0.05)的蛋白表達;顯著降低IκBα(P＜0.05)、β-casein(P＜0.05)的蛋白表達;顯著提高NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性(P＜0.05）;顯著提高TNF-α(P＜0.05)和IL-1β(P＜0.05)的濃度。與陽性對照組相比，所有劑量組β-葡聚糖能顯著降低CD14(P＜0.05)、MD2(P＜0.05)的mRNA表達;低劑量組和高劑量組β-葡聚糖能顯著降低TLR4(P＜0

8、.05)、MyD88(P＜0.05)的蛋白表達;所有劑量組β-葡聚糖能顯著提高Dectin1(P＜0.05) mRNA和蛋白表達;所有劑量組β-葡聚糖能顯著提高Syk(P＜0.05)及β-casein(P＜0.05)的蛋白表達;中劑量組和高劑量組能顯著提高IκBα(P＜0.05)的活性及顯著降低NF-κB(P＜0.05)的轉(zhuǎn)錄活性;所有劑量組β-葡聚糖能顯著漸少TNF-α(P＜0.05）和IL-1β(P＜0.05)的分泌。結(jié)果表明LPS

9、能上調(diào)大鼠乳腺上皮細胞TLR4/MyD88/IκBα(-)/NF-κB通路，β-葡聚糖則能通過上調(diào)Dectin1/Syk/IκBα(-)通路，下調(diào)TLR4/MyD88/IκBα(-)通路，降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，減少炎性細胞因子的分泌，恢復(fù)乳腺上皮細胞β-casein的分泌水平，并具有劑量依賴性。
　　 3β-葡聚糖對大鼠乳腺上皮細胞自主防御信號通路相關(guān)蛋白表達時序的影響利用LPS與原代培養(yǎng)的大鼠乳腺上皮細胞共孵育研究β-葡聚

10、糖調(diào)節(jié)大鼠乳腺上皮細胞自主防御的信號通路，并分析通路相關(guān)蛋白表達的時序。設(shè)置實驗組加入5μg/mLβ-葡聚糖，對照組加入等量DMSO處理細胞12h。更換無血清培養(yǎng)液，10μg/mLLPS處理所有細胞0、0.5及1h，于各個時間點收集細胞及細胞培養(yǎng)液。相比0h對照組，LPS作用0.5h（P＜0.05）、1h(P＜0.05)能顯著提高乳腺上皮細胞TLR4、MyD88、及Syk的蛋白表達，且TLR4及MyD88的表達在0.5h達到峰值;LPS

11、作用0.5h(P＜0.01)、1h(P＜0.01)能極顯著降低IκBα的表達;LPS作用0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)顯著提高NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性;LPS作用0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)顯著提高TNF-α的濃度且在0.5h達到峰值。與對應(yīng)時間點對照組相比，β-葡聚糖能顯著降低LPS共孵育0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)的乳腺上皮細胞MyD88的蛋白表達;顯著提高0.5h(P＜0.05)De

12、ctin1的蛋白表達;顯著提高0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)Syk及IκBα的蛋白表達;顯著降低0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05) NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性;顯著降低0.5h（P＜0.05）、1h(P＜0.05) TNF-α的分泌。此外，LPS作用0.5h能極大增強乳腺上皮細胞TLR4的熒光表達，β-葡聚糖能極大增強LPS作用0.5h乳腺上皮細胞Dectin1的熒光表達。LPS能通過激活大鼠乳腺上皮細胞TLR4的

13、表達，促進胞內(nèi)適應(yīng)子蛋白MyD88的活化，從而激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性;β-葡聚糖能通過激活大鼠乳腺上皮細胞Dectin1的表達，激活胞內(nèi)Syk的活性并拮抗胞內(nèi)適應(yīng)子蛋白MyD88的活化，降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，減少炎性細胞因子的分泌。
　　 4β-葡聚糖調(diào)節(jié)大鼠乳腺上皮細胞TLR-4及Dectin1信號通路的機理研究分別用TLR-4抑制劑5μmol/L、Syk抑制劑150 nmol/L以及NF-κB抑制劑10μmol/L預(yù)處

14、理原代培養(yǎng)的大鼠乳腺上皮細胞2h，更換無血清培養(yǎng)液。實驗分組設(shè)置為:對照組加入等量DMSO，實驗組1單獨加入5μg/mLβ-葡聚糖，實驗組2加入等量DMSO及實驗組3加入5μg/mLβ-葡聚糖，處理細胞12h。再更換無血清培養(yǎng)液，對照組加入等量DMSO，實驗組1加入等量DMSO，實驗組2單獨加入10μg/mL LPS及實驗組3加入10μg/mL LPS，所有細胞處理0、0.5、1及2h，收集細胞及細胞培養(yǎng)液。研究β-葡聚糖、LPS對3種

15、抑制劑預(yù)處理的乳腺上皮細胞的影響，重點分析相關(guān)信號通路發(fā)生的變化。
　　 在TLR4被抑制條件下，相比0h對照組，實驗組1能顯著提高所有時間點Syk(P＜0.05)的蛋白表達及0h(P＜0.05)、0.5h(P＜0.05)及1h(P＜0.05) Dectin1(P＜0.05)的蛋白表達，且都在1h達到峰值;實驗組2能顯著提高所有時間點TLR-4(P＜0.05)及MyD88(P＜0.05)的蛋白表達，其中TLR-4在0.5h達到峰

16、值，MyD88在1h達到峰值，顯著降低0h(P＜0.05)及0.5h(P＜0.05) IκBα的表達，極顯著提高所有時間點NF-κB(P＜0.01)的轉(zhuǎn)錄活性且保持穩(wěn)定，顯著提高0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05) TNF-α和1h(P＜0.05) IL-1β的濃度;實驗組3能顯著提高所有時間點Dectin1(P＜0.05)的蛋白表達，顯著提高0h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05

17、) Syk的蛋白表達，顯著提高所有時間點NF-κB(P＜0.05)的轉(zhuǎn)錄活性，其中0.5h(P＜0.01)及1h(P＜0.01)差異極顯著。與同時間點實驗組2進行比較，實驗組1所有時間點Syk(P＜0.05)的蛋白表達及0h(P＜0.05)、0.5h(P＜0.05)及1h(P＜0.05) Dectin1(P＜0.05)的蛋白表達顯著提高，所有時間點TLR-4(P＜0.05)及MyD88(P＜0.05)的蛋白表達顯著降低，0h(P＜0.0

18、5)及0.5h(P＜0.05)IκBα的表達顯著提高，所有時間點NF-κB(P＜0.01)的轉(zhuǎn)錄活性極顯著降低，0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05) TNF-α和1h(P＜0.05)IL-1β的濃度顯著降低;實驗組3所有時間點Dectin1(P＜0.05)的蛋白表達及0h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05)Syk的蛋白表達顯著提高，0h(P＜0.05)及2h(P＜0.05) NF-

19、κB(P＜0.05)的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低，其他同實驗組1。
　　 在Syk被抑制條件下，相比0h對照組，實驗組1能顯著提高所有時間點Dectin1(P＜0.05)的蛋白表達，顯著提高1h(P＜0.05)、2h(P＜0.05)Syk(P＜0.05)的蛋白表達;實驗組2能顯著提高所有時間點TLR4(P＜0.05)及0.5h(P＜0.05) MyD88的蛋白表達，顯著降低2h(P＜0.05)IκBα的表達，極顯著提高0.5h(P＜0.0

20、1)、1h（P＜0.01）及2h(P＜0.01) NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，顯著提高0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05) TNF-α和0.5h(P＜0.05) IL-1β的濃度;實驗組3能顯著提高所有時間點Dectin1(P＜0.05)的表達，顯著提高1h（P＜0.05）及2h(P＜0.05) Syk的表達，極顯著提高0.5h(P＜0.01)、1h(P＜0.01)及2h（P＜0.01）NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。與同時間點實驗組2進行比

21、較，實驗組1所有時間點Dectin1(P＜0.05)的蛋白表達及1h(P＜0.05)、2h(P＜0.05) Syk(P＜0.05)的蛋白表達顯著提高，所有時間點TLR4(P＜0.05)及0.5h(P＜0.05) MyD88的蛋白表達顯著降低，2h（P＜0.05）IκBα的表達顯著提高，0.5h(P＜0.01)、1h(P＜0.01)及2h(P＜0.01)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性極顯著降低，0.5h(P＜0.05)、1h（P＜0.05）TNF-

22、α和0.5h(P＜0.05) IL-1β的濃度顯著降低;實驗組3MyD88在0.5h的蛋白表達有所降低，但差異不顯著，0.5h、1h及2h NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性差異不顯著，其他同實驗組1。
　　 在NF-κB被抑制條件下，相比0h對照組，實驗組1能顯著提高0h(P＜0.05)、0.5h(P＜0.05)及極顯著提高1h(P＜0.01) Dectin1和Syk的蛋白表達，顯著提高1h(P＜0.01)TLR4的蛋白表達;實驗組2能顯著

23、提高所有時間點TLR4(P＜0.05)的蛋白表達且在0.5h達到峰值，顯著提高所有時間點MyD88的蛋白表達且在1h達到峰值，顯著降低1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05)IκBα的表達，顯著提高0.5h(P＜0.05)、1h（P＜0.05）NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，顯著提高0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05) TNF-α和0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05) IL-1β的濃度;實驗組3能顯著提

24、高0h(P＜0.05)、0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05) Dectin1(P＜0.05)的表達，顯著提高所有時間點Syk的蛋白表達，顯著提高0.5h(P＜0.05)、2h(P＜0.05)及極顯著提高1h(P＜0.01) NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。與同時間點實驗組2進行比較，實驗組1能顯著提高0h(P＜0.05)、0.5h(P＜0.05)及1h(P＜0.05) Dectin1和Syk的蛋白表達，0h(P＜0.05)、0.5h(P

25、＜0.05)及2h(P＜0.05) TLR4的蛋白表達顯著降低，所有時間點MyD88的蛋白表達顯著降低，1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05)IκBα的表達顯著提高，0.5h（P＜0.05）、1h(P＜0.05) NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低，0.5h（P＜0.05）、1h（P＜0.05）及2h（P＜0.05）TNF-α和1h(P＜0.05)IL-1β的濃度顯著降低;實驗組3在0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P

26、＜0.05) TLR4和MyD88的蛋白表達顯著降低，所有時間點Syk的蛋白表達顯著提高，1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性顯著提高，其他同實驗組1。
　　 在乳腺上皮細胞中TLR-4被抑制后，對Dectin1/Syk通路無明顯抑制作用，對NF-κB的活性有一定的抑制作用;在Syk激酶被抑制后，對TLR-4/MyD88通路及NF-κB的活性無明顯抑制;在乳腺上皮細胞中抑制NF-κB后，對Dectin1