蟲媒登革病毒(Mosquito-borne dengue viruses)基因組進化與分子診斷的研究.pdf

1、昆蟲媒介病毒（蟲媒病毒）是一大類主要由吸血昆蟲叮咬人、家畜及野生動物而傳播的病毒。其特點是病毒在節(jié)肢動物媒介體內(nèi)繁殖而不發(fā)病，具有自然疫源性。目前已經(jīng)證實的媒介昆蟲達586種，主要為蚊（300種）和蜱（116種）。蟲媒病毒引起人畜共患疾病，近年來備受關(guān)注。目前國際上發(fā)現(xiàn)有500多種蟲媒病毒，其中130余種可引起人畜共患疾病。同時，蟲媒病毒可隨人群流動、宿主和媒介昆蟲的遷移而傳播到異地。由于大部分蟲媒病毒感染沒有特效藥物，也沒有可用的疫苗

2、，因此蟲媒病毒的研究對病毒的預(yù)防與控制具有積極意義。登革病毒隸屬于黃病毒屬，有四個血清型（DENV-1、－2、－3和-4），經(jīng)由節(jié)肢動物白紋伊蚊（Aedes albopictus）與埃及伊蚊（Ae．a(chǎn)egypti）傳播，是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的蟲媒病毒。目前登革熱（Dengue Fever，DF）在超過100個國家流行，威脅著大約25億人口，全球每年大約有5000萬到1億人受到感染，25000人死亡。由于沒有有效的疫苗，病毒早期診斷與及

3、時醫(yī)療護理顯得尤為重要。我國建國后第一次登革熱流行發(fā)生在1978年的廣州佛山，至今登革熱已經(jīng)成為我國南方重要的公共衛(wèi)生問題，現(xiàn)已是法定的傳染病。系統(tǒng)的了解我國登革病毒三十年來分子流行病學可以闡明病毒的發(fā)生、發(fā)展，對病毒防護有指導(dǎo)意義。基于此，本研究以我國建國以來收集到的登革病毒為研究對象，從分子水平研究其流行與進化規(guī)律，同時開發(fā)了登革病毒的實時熒光PCR探針法診斷技術(shù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下： 一、蟲媒登革病毒的基因組進化

4、 1、基因組測定與比較 實驗測得收集到的14株登革病毒的DENV-1、－2和－4的基因組全長分別為10735bp、10723bp和10649bp。DENV-1的5’和3’非編碼區(qū)分別為94nt和462nt，編碼區(qū)從95位開始到10272位結(jié)束，全長10179bp，編碼3392個氨基酸。DENV-2的5’和3’非編碼區(qū)分別為96nt和454nt，編碼區(qū)從97位開始到10272位結(jié)束，全長10176bp，編碼3391個氨基酸。DEN

5、V-4的5’和3’非編碼區(qū)分別為101nt和384nt，編碼區(qū)從102位開始到10265位結(jié)束，全長10164bp，編碼3387個氨基酸。 8株DENV-1（1991～2006年）全基因組核酸序列相似性在91．8%-99．7%之間，編碼的氨基酸序列相似性在97．0%-99．7%之間；4株（1993～2001年）DENV-2全基因組核酸序列相似性在92．3%-98．8%之間，氨基酸序列相似性在96．5%-98．8%之間；2株（19

6、78和1990年）DENV-4病毒株的全基因組核苷酸相似性為93．6%，編碼的氨基酸序列相似性為96．0%。 同一血清型間5'UTR和3'UTR序列相似性非常高，僅有幾個核苷酸差異。我們比較所測的分離株單基因水平氨基酸相似性，發(fā)現(xiàn)雖然氨基酸相似性在不同年代、不同病毒株、不同蛋白區(qū)域沒有明顯規(guī)律，但總體來講，在NS3、NS4A、NS4B、NS5蛋白的氨基酸的相似性較高，而在結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域氨基酸相似性較低。同時發(fā)現(xiàn)，2002-2003

7、、2004、2006和2007四個時間點分離株的E461位點氨基酸分別為異亮氨酸（I）、纈氨酸（V）、亮氨酸（L）、丙氨酸（A），其疏水性參數(shù)分別為4．5、4．2、3．8和1．8，疏水性逐漸降低。病毒E蛋白C末端為E蛋白的轉(zhuǎn)膜區(qū)，參與病毒與宿主的識別附著，這種疏水性變化趨勢是否與病毒與人類宿主細胞相互作用的適應(yīng)有關(guān)值得進一步研究。 2、蟲媒登革病毒基因組進化 本文對1978至2006年登革熱爆發(fā)時收集的細胞分離株基因組測

8、序，結(jié)合GenBank上已經(jīng)公布的病毒序列，總共獲得145個外膜蛋白E基因序列和74個全基因組序列。基于外膜蛋白E基因與全長編碼區(qū)序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹具有很好的一致性。結(jié)果顯示：一、我國的大部分登革病毒與東南亞鄰近國家的分離株系在進化樹位置上更接近，暗示我國登革病毒大部分可能起源于登革病毒多發(fā)的東南亞國家，如泰國、菲律賓、印度尼西亞等：二、三種血清型（DENV-1、-2、-4）的蟲媒登革病毒在基因型和分支水平具有豐富的遺傳多樣性，同時

9、，血清型內(nèi)大量基因重組現(xiàn)象發(fā)生也增加了遺傳多樣性的復(fù)雜程度；三、純化選擇是登革病毒進化的主要驅(qū)動力，但在病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的94氨基酸位點檢測到強烈陽性選擇。有趣的是，NS1蛋白94位氨基酸以親水性及疏水性可以區(qū)分特定的進化血系。 二、蟲媒登革病毒的實時熒光PCR診斷 1、實時熒光PCR診斷技術(shù)的建立 通過生物信息學比對分析GenBank登陸的以及本文測序的登革病毒株系序列，利用Primer Press3軟件

10、設(shè)計實時熒光PCR特異性引物及TaqMan探針，14個登革病毒培養(yǎng)上清提取RNA評估引物及探針的特異性、靈敏度。研究表明：本試驗設(shè)計的四種型特異性引物及TaqMan探針具有特異性好（血清型間、與相近屬種、人類基因組、蚊蟲細胞間無交叉反應(yīng)）、敏感性高（最低檢測限為15-80拷貝RNN反應(yīng)）等特點，可用于診斷登革病毒感染。 2、實時熒光PCR診斷技術(shù)的初步應(yīng)用 近年來我國南方發(fā)生的登革病毒大部分是血清Ⅰ型。本文收集到2006

11、年廣州Ⅰ型血清型病毒流行時64份不同病程的病人臨床血清樣品，評估上述建立的診斷方法的應(yīng)用性。結(jié)果表明：一、本研究開發(fā)的實時熒光PCR診斷方法檢測陽性率為71．9%（46/64），而傳統(tǒng)的免疫熒光分析法（IFA）檢測的陽性率IgM為54．7%（35/64），IgG為34．4%（22/64），顯示實時熒光PCR診斷方法具有較好的應(yīng)用性；二、本文開發(fā)的實時熒光PCR診斷方法對登革熱癥狀起始1-3天病人血清檢測陽性率高達86．4%（19/22）