金葡菌毒力調(diào)節(jié)因子RAP及TRAP的基礎(chǔ)研究.pdf

1、RNAⅢ分子是調(diào)控金黃色葡萄球菌毒力因子表達(dá)的關(guān)鍵分子.最新的研究認(rèn)為,金葡菌分泌的RAP(RNAⅢ activating protein)能磷酸化其靶蛋白TRAP,從而激活RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄.但是目前對RAP尚存在爭議,因而RAP-TRAP通路仍需詳盡的研究.參照文獻(xiàn)報道的方法,我們實驗室從金葡菌的培養(yǎng)上清中初步純化到了能夠激活RNAⅢ轉(zhuǎn)錄的成分(RAP樣蛋白),以這些粗純成分為靶,從噬菌體隨機(jī)展示肽庫中篩選到了具有抑制RNAⅢ轉(zhuǎn)錄活性的

2、結(jié)合肽序列R15.另外生物質(zhì)譜鑒定了其中的蛋白條帶.該課題的目的是在以上工作的基礎(chǔ)上對RAP-TRAP毒力調(diào)節(jié)通路進(jìn)行深入的研究.該研究首先利用大腸桿菌分別表達(dá)了生物質(zhì)譜鑒定出的Beta-溶血素和PV白細(xì)胞毒素S蛋白(均去除了信號肽部分).Northern Blot證實表達(dá)的這兩種蛋白均不具有RNAⅢ激活活性.截留金葡菌培養(yǎng)上清,證實確實存在大于10kD的RNAⅢ激活成分.可能是RAP特殊的理化特性而使得對它的鑒定成為研究的瓶頸.接著,

3、我們對作用肯定的TRAP蛋白進(jìn)行了深入探討,包括TRAP蛋白的細(xì)胞定位和TRAP細(xì)胞外結(jié)合蛋白的釣取、鑒定.與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果不同,我們發(fā)現(xiàn)TRAP可能是細(xì)胞表面蛋白或者是分泌型表達(dá)的,它能夠結(jié)合細(xì)胞外的自溶素蛋白.抗TRAP的多克隆抗體能夠升高金葡菌自溶素的分泌水平.我們推測TRAP與自溶素蛋白可能會形成一條新的密度感應(yīng)通路.該研究還進(jìn)行了應(yīng)用方面的嘗試.利用原核表達(dá)系統(tǒng),將R15肽與人IgG1的Fc片段進(jìn)行了融合表達(dá).MDBK細(xì)胞