胃飼乙醇預處理增強肝臟對缺血再灌注損傷耐受性的實驗研究.pdf

1、本研究的目的在于在以往研究的基礎上進一步探討通過胃飼乙醇預處理能否延長大鼠肝臟耐受入肝血流阻斷的安全時限。 以門靜脈轉流下的肝臟缺血再灌流模型為基礎，并采用前期實驗已建立的胃飼乙醇預處理方法：術前24h給予大鼠胃飼40％乙醇5g/Kg。健康成年Wistar大鼠，雌雄不限，隨機分為：肝臟缺血手術組(IR)和胃飼乙醇預處理組(EPC)。胃飼40％乙醇5g/Kg24h后行肝臟缺血手術，肝門阻斷時間為120min。阻斷期間觀察肝臟缺血情

2、況、胃腸道淤血情況。觀察動物存活時間為2周。如果20只大鼠中在觀察時間內出現(xiàn)1只以上死亡，則將缺血時間縮短至110min，繼續(xù)觀察存活情況，如動物仍有死亡則將缺血時間繼續(xù)減少至100min；如果大鼠無死亡，則缺血時間可繼續(xù)延長，直至動物出現(xiàn)死亡。以動物存活率為100％的入肝血流阻斷時間初步設定為最大安全時限。 結果發(fā)現(xiàn),胃飼乙醇后，動物中毒癥狀輕微，很快完全恢復；術中肝門阻斷后，胃腸道無明顯淤血;肝臟缺血120min后，EPC組

3、術后2周內無動物死亡，存活率為100％；IR組術后2周內存活率為70％;阻斷肝臟血流時間延長后，各組死亡數(shù)增高。肝臟缺血130min后，EPC組術后2周內動物存活率為80％，IR組術后2周內存活率為60％;與EPC缺血120組相比，IR缺血120min組、EPC缺血130min及IR缺血130min組死亡率均明顯增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。根據(jù)此結果，可將大鼠入肝血流阻斷的最大安全時限初步設定為120min，進一步驗證。

4、 實驗提示，經胃飼乙醇預處理后可能延長大鼠肝臟對缺血耐受的最大安全時限至120min。 本實驗以胃飼乙醇預處理模式為處理因素，探討其對120min缺血時肝臟的保護作用，以進一步證明該預處理后大鼠肝臟耐受缺血的最大安全時限可延長至120min。實驗分為：正常對照組(N)、胃飼乙醇組(E組)、肝臟缺血手術組(IR組)、生理鹽水預處理組(NPC組)、胃飼乙醇預處理組(EPC組)和缺血預處理組(IPC組)。于再灌注0h、3h、6h

5、、12h、24h、72h及1w活殺動物，留取下腔靜脈血以及右肝前葉組織，以存活率、肝功能、肝組織ATP含量、肝細胞凋亡及病理形態(tài)學為觀察指標。 結果發(fā)現(xiàn),術中動物麻醉平穩(wěn)，胃腸道未見明顯淤血。術后EPC組恢復平穩(wěn)順利，24h后能自由飲食及活動；IPC組、NPC組及IR組在術后動物全身狀況較差，36h后方能自由活動。EPC組動物術后1w內存活率為100％，IPC組存活率為78％，IR組存活率為78％，NPC組存活率為83％，EPC

6、組與其余各手術組術后存活率相比差異顯著(p＜0.05);E組ALT于相應各個檢測時相與正常組對照無顯著差異(p＞0.05)，各手術組于再灌流72h后ALT值與正常組相比無明顯差異(p＞0.05)，EPC組再灌流6h、24h顯著低于NPC組(p＜0.05)，再灌流0h、6h顯著低于IR組(p＜0.05)，與IPC組相比無明顯差異(P＞0.05)，但各時相的ALT值均低于IPC組；NPC組與IR組再灌流后ALT變化規(guī)律相近，在各個時相無顯著

7、差異(P＞0.05);E組AST值于相應各個檢測時相與正常組無顯著差異(p＞0.05)；各手術組AST值均顯著高于正常組(p＜0.01)，于再灌流72h后AST值與正常組相比無明顯差異(p＞0.05)；EPC組各時相的AST值與IR組、NPC組及IPC組相比無明顯差異(p＞0.05);各組動物肝組織ATP含量比較：E組、EPC組于再灌流12h后逐漸恢復，與正常組無顯著差異(P＞0.05)；其余各手術組動物于再灌流72h后逐漸恢復正常；I

8、R組和EPC組無顯著差異(P＞0.05)，但各時相IR組的ATP值均低于EPC組；NPC組再灌流12h、IPC組再灌流24h的ATP值明顯低于EPC組相應時相點的ATP值(p＜0.05);肝組織病理觀察：IR組和NPC組可見肝竇內淤血及廣泛肝細胞變性及大量壞死，匯管區(qū)炎癥細胞聚集，部分肝小葉正常結構破壞；而EPC組、IPC組明顯較前兩者病理損害輕，可見肝細胞濁腫變性，散在肝細胞壞死，肝小葉結構完整，未見明顯組織結構破壞。根據(jù)肝臟再灌流2

9、4h各組病理分級，EPC組明顯優(yōu)于IR及NPC組;Tunel染色法檢測各手術組術后肝細胞凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)：EPC組肝細胞凋亡數(shù)目于再灌流24h、72h顯著少于IPC組，于再灌注1w低于IR組及NPC組；IR組與NPC組各時相點無明顯差異，兩組于再灌注12h、24h未發(fā)現(xiàn)典型的凋亡細胞，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這兩個時相點IR組與NPC組肝細胞發(fā)生大面積壞死，匯管區(qū)中性粒細胞浸潤。提示胃飼乙醇預處理對肝臟120min缺血再灌流損傷具有明顯的保護作

10、用。 采用免疫組織化學方法觀測胃飼乙醇以及乙醇預處理對缺血再灌流后肝臟HO-1表達的影響，研究HO-1與肝臟缺血再灌注耐受性的關系，初步研究胃飼乙醇預處理對肝臟缺血再灌注損傷保護作用的分子機制。在正常大鼠肝組織內僅Kupffer細胞有微弱表達，肝細胞內未發(fā)現(xiàn)陽性表達;胃飼乙醇可以誘導HO-1的生成，乙醇胃飼后24hHO-1達到高峰，逐漸減弱，48h后幾乎無陽性表達;胃飼乙醇預處理對120min缺血再灌注損傷肝臟HO-1表達的影響

11、：EPC組HO-1于再灌注0h即有陽性表達，隨時相延長表達逐漸增強，6h明顯增強，持續(xù)至12h達到最強，24h后逐漸減弱，至1w仍有弱陽性表達。每一時相點比較，EPC組HO-1陽性表達均顯著高于其余各組，隨時相延長相差明顯。HO-1增強表達與胃飼乙醇預處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用相一致，提示胃飼乙醇預處理對肝臟缺血-再灌注具有一定的保護作用，而HO-1可能是其保護作用的物質基礎之一。 結論:適當劑量濃度范圍的乙醇胃飼是一種

12、安全有效的預處理模式，40％乙醇5g/kg胃飼后24h行肝臟缺血手術可以增強肝臟對缺血再灌注損傷的耐受性，經該預處理可以延長大鼠肝臟耐受缺血的最大安全時限至120min。 胃飼乙醇預處理在肝臟缺血120min時，可以明顯增強肝臟對缺血再灌注損傷的耐受性，有效減少肝細胞的壞死和凋亡，更大程度地保留肝組織ATP含量，有效抑制肝臟ALT的釋放，從形態(tài)結構及肝細胞功能上發(fā)揮保護作用。 胃飼乙醇預處理可以有效增強肝臟缺血再灌注損傷