置換探針實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)微生物耐藥突變.pdf

1、本論文應(yīng)用熒光置換探針技術(shù)，以乙型肝炎病毒在拉米夫定治療過程中產(chǎn)生的耐藥突變和多重耐藥結(jié)核分枝桿菌為研究對(duì)象，考察熒光置換探針用于低GC含量和高GC含量突變基因的多位點(diǎn)檢測(cè)情況，建立了可應(yīng)用于多突變位點(diǎn)病原微生物檢測(cè)的多色均相熒光PCR系統(tǒng)。 快速有效的檢測(cè)乙型肝炎病毒抗拉米夫定耐藥突變，對(duì)于臨床診斷和治療具有重要的意義。本論文建立了于單管實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)血清標(biāo)本中存在的多個(gè)拉米夫定耐藥突變的體系。應(yīng)用4對(duì)標(biāo)記了不同熒光

2、基團(tuán)的堿基特異性置換探針，通過單個(gè)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)就能判斷標(biāo)本中包含了以下任何一種HBV DNA：野生型，rtM204突變型，野生和rtM204突變混合型，rtM204突變和rtL180突變混合型，野生、rtM204突變和rtL180突變混合型。我們考察了檢測(cè)體系的靈敏度、特異性和檢測(cè)雜合比例的能力，并應(yīng)用該體系完成了50份已知包含拉米夫定耐藥突變的HBV血清標(biāo)本和36份HBeAg陽性的HBV血清標(biāo)本的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，和DNA測(cè)序結(jié)果

3、相比，該體系表現(xiàn)出更高的靈敏度和更強(qiáng)的檢測(cè)雜合比例的能力。該方法可以檢測(cè)出低至102～103copies/mL的HBV，并且可以檢測(cè)出在大量的野生型DNA中的5％的突變型DNA。應(yīng)用這種高通量的檢測(cè)體系能夠?qū)估追蚨℉BV進(jìn)行更早的診斷。 目前臨床上用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性的方法，因?yàn)槭艿郊?xì)菌生長(zhǎng)速度的限制，一般需要數(shù)周的時(shí)間，不利于臨床診斷和治療。針對(duì)4種治療結(jié)核的一線藥物，在確定結(jié)核分枝桿菌存在的前提下，本論

4、文建立了兩個(gè)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥突變的體系： 一是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌抗利福平耐藥突變中最常見的RNA聚合酶基因(rpoB)突變，建立了在單管PCR反應(yīng)中實(shí)時(shí)檢測(cè)rpoB核心位點(diǎn)發(fā)生的所有突變的體系。在結(jié)核分枝桿菌耐利福平分離株中，95％的突變發(fā)生在rpoB507位至533位27個(gè)氨基酸密碼子(81bp)組成的區(qū)域內(nèi)。應(yīng)用4對(duì)標(biāo)記了不同熒光基團(tuán)的堿基特異性置換探針，覆蓋rpoB 81bp的大部分區(qū)域，一旦所檢測(cè)的區(qū)域發(fā)生了突變就會(huì)造

5、成相應(yīng)探針的熒光信號(hào)的消失，從而達(dá)到檢測(cè)突變的目的。結(jié)果表明，該體系可以檢測(cè)出低至5個(gè)拷貝的結(jié)核分枝桿菌，并且具有很高的特異性。應(yīng)用該體系完成了9份已知基因型的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)標(biāo)本和123份痰標(biāo)本的檢測(cè)。痰標(biāo)本中101份為野生型，5份526位點(diǎn)發(fā)生突變，16份531位點(diǎn)發(fā)生突變，1份526和531位點(diǎn)同時(shí)突變。所有檢測(cè)結(jié)果均通過DNA測(cè)序驗(yàn)證。 二是建立了同時(shí)檢測(cè)三種一線藥物的結(jié)核分枝桿菌耐藥突變的熒光PCR檢測(cè)方法。將熒光雙鏈

6、置換探針、實(shí)時(shí)PCR和多重PCR相結(jié)合，針對(duì)三種一線藥物鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇中最常見的并且都是由于點(diǎn)突變而導(dǎo)致的耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用該體系檢測(cè)了9份已知基因型的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)標(biāo)本和118份痰標(biāo)本，其中93份痰標(biāo)本未發(fā)生突變，8份痰標(biāo)本發(fā)生耐鏈霉素突變，6份痰標(biāo)本發(fā)生耐異煙肼突變，1份痰標(biāo)本發(fā)生耐乙胺丁醇突變，2份痰標(biāo)本發(fā)生同時(shí)耐鏈霉素和異煙肼的突變，8份痰標(biāo)本發(fā)生同時(shí)耐鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇的突變，所有檢測(cè)結(jié)果均通過ARM