樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)供體脾淋巴細(xì)胞過(guò)繼性免疫治療預(yù)防肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型的建立目的：掌握大鼠肝移植模型的制作方法，結(jié)合國(guó)內(nèi)外報(bào)道，對(duì)大鼠肝移植模型進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)，并觀察以SD大鼠為供體Wistar大鼠為受體時(shí)免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的情況，建立穩(wěn)定的大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型。 材料和方法：應(yīng)用Kamada“二袖套法”行大鼠肝移植，在既往國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上對(duì)供肝切取、灌注、袖套管制作、受體麻醉、肝上下腔靜脈吻合和縮短無(wú)肝期等方面進(jìn)行改進(jìn)，熟練實(shí)驗(yàn)操作。行SD→Wistar

2、大鼠肝移植20例，并隨機(jī)分為排斥反應(yīng)組、環(huán)孢霉素A處理組(CsA，5mg/kg)各10例，以Wistar→Wistar同系移植組10例作為對(duì)照組，觀察移植術(shù)后免疫排斥情況。結(jié)果：供體手術(shù)時(shí)間29.6±5.2min，供肝修整時(shí)間20.1±3.3min，受體總手術(shù)時(shí)間45.7±5.9min，受體無(wú)肝期17.2±2.4min，肝上下腔靜脈縫合時(shí)間10.5±2.2min，手術(shù)成功率93.3％。排斥反應(yīng)組大鼠術(shù)后逐漸出現(xiàn)黃疸、腹水等表現(xiàn)，肝功能進(jìn)

3、行性惡化、最終出現(xiàn)肝功能衰竭癥狀而死亡，生存期5～15天，組織病理學(xué)提示有典型的免疫排斥，而對(duì)照組和CsA治療組大鼠均存活1月以上。術(shù)后第7天排斥反應(yīng)組血清IFN-γ、IL-4水平顯著升高，而應(yīng)用CsA治療組血清IFN-γ和IL-4水平處于低水平。 結(jié)論：對(duì)大鼠肝移植技術(shù)進(jìn)行改良可明顯提高移植大鼠的生存率。以SD大鼠為供體，Wistar大鼠為受體的組合為高排異組合，可以建立穩(wěn)定的肝移植急性排斥反應(yīng)模型。IFN-γ是排斥反應(yīng)中起作

4、用的主要細(xì)胞因子，它的高表達(dá)可以引起同種異體大鼠肝移植的排斥反應(yīng)，是一個(gè)良好的檢測(cè)排斥反應(yīng)的指標(biāo)。CsA抑制了T淋巴細(xì)胞的激活和向Th1、Th2型細(xì)胞的分化，從而抑制宿主的免疫排斥反應(yīng)，但并未使移植肝臟向著免疫耐受的方向發(fā)展。 第二部分大鼠肝癌肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)模型的建立目的：通過(guò)大鼠肝癌肝移植后免疫抑制的狀態(tài)下接種腫瘤組織塊來(lái)模擬臨床中同種異體肝移植后肝癌復(fù)發(fā)的進(jìn)程，在總結(jié)既往建模方法的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)改進(jìn)，建立穩(wěn)定的肝移植后肝癌復(fù)

5、發(fā)模型，為術(shù)后進(jìn)行預(yù)防、治療復(fù)發(fā)，觀察療效和各種治療對(duì)供肝的影響提供研究平臺(tái)。 材料和方法：應(yīng)用Wistar大鼠肝癌細(xì)胞系CBRH-7919(中科院上海細(xì)胞庫(kù))經(jīng)過(guò)培養(yǎng)傳代、皮下成瘤、肝內(nèi)接種等過(guò)程建立了大鼠的種植性肝癌模型。行SD→Wistar的大鼠移植，免疫抑制狀態(tài)下肝內(nèi)植入瘤塊，分為肝移植術(shù)中植瘤組和術(shù)后1周植瘤組，并以免疫抑制狀態(tài)下的未行移植的Wistar大鼠作為對(duì)照組，觀察各組大鼠的成瘤率，在B超下觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，繪

6、制生長(zhǎng)曲線。 結(jié)果：大鼠皮下注射癌細(xì)胞2周后，可見鼠膝部接種部位皮下有明顯隆起的結(jié)節(jié)狀腫物，直徑0.94±0.21cm(n=5)，鏡下見瘤細(xì)胞核大，深染，細(xì)胞大小不等，形態(tài)不規(guī)則，核漿比例大，核分裂易見，形態(tài)學(xué)符合肝細(xì)胞癌表現(xiàn)。肝移植術(shù)中植瘤組5只大鼠僅1只成瘤，成瘤率為20％，對(duì)照組和術(shù)后植瘤組各5只大鼠全部成瘤，成瘤率為100％。術(shù)中植瘤組大鼠腫瘤生長(zhǎng)速度明顯降低。結(jié)論：肝移植術(shù)后1周在免疫抑制的狀態(tài)下肝內(nèi)接種瘤塊成瘤，建立

7、了和臨床過(guò)程較為一致的肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的大鼠模型，該模型模擬了臨床上同種異體肝移植應(yīng)用免疫抑制劑抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)也模擬了肝癌的復(fù)發(fā)，是安全、可靠的建模方法。同時(shí)該模型模擬了肝移植后肝癌肺轉(zhuǎn)移的過(guò)程。 第三部分樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)供體脾淋巴細(xì)胞對(duì)肝移植受體肝癌復(fù)發(fā)的作用目的：探討肝癌肝移植后應(yīng)用負(fù)載受體肝癌抗原的樹突狀細(xì)胞(DC)誘導(dǎo)活化供體脾臟來(lái)源的特異性淋巴細(xì)胞，對(duì)受體肝癌實(shí)施過(guò)繼性免疫治療的可行性和有效性，以期在不引起對(duì)移

8、植肝損傷或排斥的情況下，產(chǎn)生更為有效的針對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，尋找有效減少肝癌肝移植的術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的免疫治療新方法。 材料和方法：以培養(yǎng)粘附法體外分離培養(yǎng)Wistar大鼠骨髓DC前體細(xì)胞，加入細(xì)胞因子rrGM-CSF和rrIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)5天，經(jīng)倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察、免疫組化鑒定證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞具備DC典型特征，并與Wistar大鼠肝癌細(xì)胞CBRH-7919反復(fù)凍融制成的裂解物抗原共同孵育2天，形成負(fù)載癌抗原的DC細(xì)胞。以此DC

9、細(xì)胞分別誘導(dǎo)受體、供體來(lái)源的癌抗原預(yù)致敏的脾細(xì)胞作為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組C、D，以低劑量IL-2維持培養(yǎng)的受、供體脾細(xì)胞作為對(duì)照組A、B。對(duì)比活化、非活化和供體來(lái)源、受體來(lái)源的脾淋巴細(xì)胞在體外對(duì)受體腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，檢測(cè)培養(yǎng)上清液IFN-γ水平。以上述不同來(lái)源和處理的脾淋巴細(xì)胞對(duì)SD→Wistar大鼠肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)模型行過(guò)繼性免疫治療，以鹽水作為對(duì)照組E，每組6只大鼠，觀察各組免疫治療對(duì)于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、成瘤率、腫瘤生長(zhǎng)情況、大鼠生存情況、

10、肝臟損害、供肝的排斥反應(yīng)、受體不良反應(yīng)和受體體內(nèi)細(xì)胞因子的影響。 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DC誘導(dǎo)脾細(xì)胞過(guò)程中，供體脾細(xì)胞活化組培養(yǎng)上清液IFN-γ分泌最高，活化組較未活化組有明顯的升高。經(jīng)負(fù)載癌抗原的DC誘導(dǎo)的脾細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性較未經(jīng)抗原誘導(dǎo)的脾細(xì)胞明顯增強(qiáng)，供體來(lái)源的脾淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原誘導(dǎo)后對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性較受體來(lái)源脾淋巴細(xì)胞顯著增強(qiáng)，未經(jīng)抗原誘導(dǎo)的供受體脾細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明顯的殺傷作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示：負(fù)載癌抗

11、原的DC誘導(dǎo)的供體脾細(xì)胞回輸體內(nèi)后，在移植后大鼠體內(nèi)觀察到了腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的增多，腫瘤細(xì)胞壞死，腫瘤生長(zhǎng)的延遲，成瘤率的下降和生存期的延長(zhǎng)，同時(shí)，免疫治療前后肝功能無(wú)明顯變化，未觀察到供肝中重度排斥反應(yīng)的發(fā)生，受體能夠很好的耐受這種免疫治療，未發(fā)現(xiàn)可見的不良反應(yīng)和由于免疫治療引起的死亡。受體來(lái)源經(jīng)抗原誘導(dǎo)的脾細(xì)胞體內(nèi)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)也顯示出了一定的抑制作用，如生存期的延長(zhǎng)，腫瘤生長(zhǎng)有所減慢，但與供體脾細(xì)胞誘導(dǎo)后的抑瘤作用具有顯著性差異，復(fù)

12、發(fā)率并沒有明顯下降，且觀察到受體血清轉(zhuǎn)氨酶的一過(guò)性升高。未經(jīng)抗原誘導(dǎo)的供受體脾細(xì)胞回輸后未產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果。各種針對(duì)腫瘤的免疫治療方案并未引起受體循環(huán)中Th1、Th2型細(xì)胞因子水平的顯著提高，未觀察到移植肝2、3級(jí)排斥反應(yīng)的發(fā)生。 結(jié)論：負(fù)載癌抗原的DC誘導(dǎo)供體脾淋巴細(xì)胞對(duì)肝移植受體進(jìn)行過(guò)繼性免疫治療對(duì)于該動(dòng)物模型是一種實(shí)用、安全且有效的免疫治療方案，可以在不影響移植肝功能、不增加對(duì)移植肝排斥反應(yīng)的同時(shí)，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率、減慢