骨骼肌環(huán)核苷酸磷酸二酯酶表達(dá)與活性及其中藥作用研究.pdf

1、環(huán)核苷酸(cAMP、GMP)作為第二信使，在各種組織細(xì)胞增殖、分化和終末細(xì)胞功能中扮演著重要的角色，而磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP、cGMP水平的關(guān)鍵酶。為探討中藥能否通過調(diào)節(jié)骨骼肌PDE提高環(huán)核苷酸水平，促進(jìn)動(dòng)物生長，本研究運(yùn)用RT-PCR、細(xì)胞培養(yǎng)、HPLC、ISA、免疫細(xì)胞化學(xué)和圖像分析等技術(shù)，進(jìn)行了骨骼肌組織和細(xì)胞10個(gè)PDE家族的18個(gè)同功酶亞型mRNA表達(dá)，中藥調(diào)節(jié)骨骼肌cAM

2、P PDE活性，中藥促骨骼肌原代培養(yǎng)細(xì)胞蛋白合成作用，以及對中藥促動(dòng)物生長作用的研究。結(jié)果如下： 成功設(shè)計(jì)了18對PDE引物，通過RT-PCR方法檢測到中國實(shí)驗(yàn)用小型豬骨骼肌組織除PDE1B和PDE11A外共16個(gè)同功酶亞型mRNA表達(dá)；ICR小鼠骨骼肌組織和細(xì)胞除PDE8B外共17個(gè)同功酶亞型mRNA表達(dá)；各亞型mRNA表達(dá)程度存在差異；豬和鼠骨骼肌組織和細(xì)胞中以cAMP特異性的PDE4A、PDE4B和PDE7A為主要表達(dá)。

3、 HPLC法檢測了近200種常用中藥對小鼠骨骼肌組織cAMP PDE活性的影響，秦皮等18味中藥對cAMP：PDE活性具有促進(jìn)作用：其余中藥對cAMP PDE活性有不同程度的抑制作用，其中石韋等62味中藥的抑制率超過20％；抑制率超過50％的中藥有青皮、密蒙花、玄參、生艾葉、木瓜、地骨皮、牛蒡子、附子、枳實(shí)、胡黃連10味中藥。 細(xì)胞培養(yǎng)、HPLC、ELISA和考馬斯亮藍(lán)方法檢測到中藥牛蒡子有效成分牛蒡子苷在濃度為2.5μg

4、/ml時(shí)，顯著抑制骨骼肌原代培養(yǎng)細(xì)胞cAMP PDE活性(P<0.01)，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP含量(P<0.05)，促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成(P<0.01)；RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和圖像分析技術(shù)檢測結(jié)果表明，主要表達(dá)的cAMP特異性PDE包括PDE4A、PDE4B和PDE7A的mRNA表達(dá)和蛋白合成無明顯變化(P>0.05)。 HPLC和ELISA等方法檢測到中藥牛蒡子的三個(gè)濃度和其有效成分牛蒡子苷的兩個(gè)低濃度都能極顯著抑制骨

5、骼肌組織cAMP PDE活性(P<0.01或P<0.001)，顯著或極顯著提高骨骼肌組織cAMP含量(P<0.05或P<0.01或P<0.001)，三個(gè)濃度的牛蒡子都能極顯著提高血漿中cAMP水平(P<0.01或P<0.001)，而三個(gè)濃度的牛蒡子苷能夠使cAMP水平顯著提高(P<0.05)。 動(dòng)物喂養(yǎng)試驗(yàn)表明，牛蒡子苷能顯著提高小鼠生長速度，牛蒡子能極顯著提高小鼠生長速度。其作用主要是通過抑制PDE活性，升高cAMP水平，進(jìn)而

6、促進(jìn)蛋白合成實(shí)現(xiàn)。 上述結(jié)果表明，PDE同功酶在骨骼肌組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，以cAMP特異性PDE為主要分布；大部分常用中藥對骨骼肌cAMP PDE活性都有抑制作用；對骨骼肌cAMP PDE活性具有較高抑制率的中藥能夠提高cAMP含量，促進(jìn)骨骼肌原代培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，并促進(jìn)動(dòng)物生長。 本研究探討了骨骼肌PDE同功酶表達(dá)規(guī)律，驗(yàn)證了第二信使環(huán)核苷酸在骨骼肌生長過程中的作用，證明了中藥通過抑制PDE活性，升高cAMP水平促