益氣養(yǎng)陰活血方治療糖尿病腎病的實驗研究及遠期療效觀察.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見和主要的慢性微血管并發(fā)癥，早期表現(xiàn)為尿中微量蛋白，繼而出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫、高血壓、腎功能不全，最終發(fā)展至終末期腎病(ESRD)。DN時，腎小球系膜細胞是主要的受累細胞，高血糖作為糖尿病最基本的生化特征，可激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路并增加其下游產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)、轉化生長因子(TGF-β1)及纖維連接蛋白(FN)的表達，引起早期腎小球高濾過、細胞外基質(zhì)(ECM)合成

2、增多，導致DN的發(fā)生、發(fā)展。目前關于中藥復方對DN時ERK通路的影響多數(shù)是動物體內(nèi)試驗，體外實驗報道較少，且多數(shù)側重在其非血流動力學效應。中醫(yī)藥在防治DN方面有較大優(yōu)勢，國內(nèi)關于中醫(yī)藥治療DN的臨床研究一般療程較短，隨訪超過2年的報道較少，多數(shù)采用隨機對照試驗，用藥及治療方案單一，臨床推廣性低，且評價指標側重在實驗室指標及臨床癥狀，缺少對終點事件的評價。本課題乃中國中醫(yī)科學院優(yōu)勢病種的后續(xù)研究，益氣養(yǎng)陰活血方是導師治療DN的經(jīng)驗方，短期

3、療效觀察可以降低DN患者尿蛋白排泄率，改善生存質(zhì)量，但其作用機制之前并未做相關實驗研究，且缺乏遠期療效觀察。
　　研究目的：
　　1、實驗研究：探討益氣養(yǎng)陰活血方通過抑制腎小球系膜細胞的增殖、ERK通路的活化及其下游產(chǎn)物的表達而治療糖尿病腎病的作用機制。
　　2、臨床研究：整體評價以益氣養(yǎng)陰活血方為主的中醫(yī)辨證治療糖尿病腎病的遠期療效，發(fā)掘中醫(yī)治療本病的特色與優(yōu)勢，為完善中醫(yī)規(guī)范化治療方案和整體療效評價體系提供參考。<

4、br>　　研究方法：
　　1、實驗研究
　　1.1研究對象：大鼠腎小球系膜細胞。
　　1.2干預措施：以高糖作為刺激因素誘導系膜細胞增殖及ERK通路活化，予益氣養(yǎng)陰活血方和福辛普利含藥血清加以干預，根據(jù)培養(yǎng)條件不同，將系膜細胞分為6組：正常血糖組、高糖組、高糖+福辛普利組和高糖+高、中、低濃度中藥組。
　　1.3觀察指標：培養(yǎng)6h、12h、24h、48h、72h后，用Western-blot法檢測系膜細胞磷酸化E

5、RK1/2(pERK1/2)蛋白的表達，Real time-PCR法檢測系膜細胞TGF-β1基因的表達，ELISA法檢測細胞上清液中PGE2和FN的含量。在培養(yǎng)24h、48h、72h時，用4-甲偶氮唑藍(MTT)法檢測系膜細胞的增殖。
　　2、臨床研究
　　2.1研究對象：2006年12月～2009年12月間在望京醫(yī)院住院或者門診治療的糖尿病腎病患者。
　　2.2干預措施：以益氣養(yǎng)陰活血方為主的中醫(yī)辨證治療作為暴露因素

6、，將既往病例劃分為兩個隊列：(1)中西醫(yī)結合隊列(治療組)，接受以益氣養(yǎng)陰活血方為主的中醫(yī)辨證治療+西醫(yī)基礎治療；(2)西醫(yī)隊列(對照組)，接受單純西醫(yī)基礎治。對兩組病例進行回顧性觀察。
　　2.3觀察指標：蛋白尿、腎功能進展，終末期腎病(ESRD)和死亡各類終點事件；實驗室指標療效、臨床癥狀療效和疾病綜合療效；生存質(zhì)量及營養(yǎng)狀態(tài)評估。
　　研究結果：
　　1、實驗研究
　　1.1高糖刺激24h、48h后能顯著促

7、進系膜細胞增殖，但至72h，高糖促細胞增殖趨勢下降，與正常組相比無顯著差異。福辛普利和高濃度中藥含藥血清組均可明顯抑制高糖引起的系膜細胞增殖，兩組間未見顯著差異。中濃度中藥組僅在24h表現(xiàn)出明顯的抑制作用，低濃度中藥組均未見抑制作用。
　　1.2高糖刺激6h后系膜細胞中pERK1/2蛋白的表達即明顯升高，隨時間延長表達逐漸增高，24h達到高峰，后逐漸減弱，至72h恢復至與正常組同等表達水平。福辛普利和高濃度中藥組在6h-48h均顯

8、著抑制ERK的活化，兩組在各時間點均無明顯差異。中濃度中藥組在6h-24h亦表現(xiàn)出明顯的抑制作用。而低濃度中藥組僅在12h可見明顯的抑制作用。
　　1.3與正常組相比較，高糖組TGF-β1mRNA的表達從12h開始明顯升高，F(xiàn)N的表達則從24h開始明顯升高，隨著時間延長，至72h升高趨勢更為顯著。高濃度中藥組在各時間點均可顯著的抑制TGF-β1mRNA、FN表達的升高。福辛普利組在早期有明顯抑制作用，中濃度中藥組在后期有明顯抑制作

9、用。低濃度中藥組均未見抑制作用。
　　1.4隨著ERK通路的激活，高糖組PGE2的表達在6h即明顯升高，48h表達量達到峰值，至72h PGE2的表達較正常組仍有明顯升高，但表達量較48h有所降低。高濃度中藥組在12-48h可明顯抑制PGE2的升高，中濃度中藥組在24h、48h亦可明顯抑制PGE2的升高。福辛普利組和低濃度中藥組均未見抑制作用。
　　2、臨床研究
　　本研究共納入病例105例，其中治療組67例，對照組3

10、8例，隨訪時間(從首次納入觀察到末次隨訪)為2-5年，治療組中位隨訪時間為3.6年，對照組中位隨訪時間為3.8年。兩組基線資料經(jīng)比較具有可比性。
　　2.1治療組蛋白尿療效總有效率52.9％，對照組總有效率28.6％，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。治療組蛋白尿終點事件的總發(fā)生率為14.9％，對照組總發(fā)生率為34.2％，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。其中治療組早期DN進入臨床期DN的發(fā)生率為16.1％，對照組發(fā)生率為47.4％，兩組比較差異

11、有統(tǒng)計學意義。治療組尿蛋白程度進展的發(fā)生率為13.9％，對照組發(fā)生率為21.1％，兩組比較無統(tǒng)計學差異。
　　2.2治療組腎功能療效總有效率62.5％，對照組總有效率20％，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。治療組CKD進展的發(fā)生率為14.9％，對照組發(fā)生率為34.2％，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。治療組Scr由正常進展至異常的發(fā)生率為3.9％，對照組發(fā)生率為17.9％，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。治療組Scr異常者數(shù)值翻倍或升高≥50％的發(fā)

12、生率為12.5％，對照組發(fā)生率為50％，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.3治療組臨床癥狀療效總有效率58.2％，對照組總有效率31.6％，兩組比較差異有明顯統(tǒng)計學意義。
　　2.4治療組綜合療效總有效率40.3％，對照組總有效率21.1％，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.5治療組ESRD發(fā)生率為3％，對照組發(fā)生率為13.2％；兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.6治療組死亡率為7.5％，對照組死亡率為10

13、.5％；兩組比較無統(tǒng)計學差異。
　　2.7治療組和對照組普適性生存質(zhì)量及糖尿病特異性生存質(zhì)量積分比較，差異有明顯統(tǒng)計學意義。
　　2.8治療組營養(yǎng)不良風險的發(fā)生率為14.9％，對照組發(fā)生率為31.6％，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1、實驗研究：益氣養(yǎng)陰活血方可抑制早期系膜細胞的增殖、ERK通路的活化及其下游產(chǎn)物PGE2、TGF-β1和FN的表達升高，對ERK通路所引起的血流動力學效應和非血流動力學

14、效應均有干預作用，這可能是其臨床作用機制所在。
　　2、臨床研究：以益氣養(yǎng)陰活血方為主的中醫(yī)辨證治療能較好地改善臨床癥狀；延緩早期蛋白尿的進展；保護腎臟、延緩腎功能的進展及ESRD的進程，改善DN的腎臟預后；提高生存質(zhì)量、改善營養(yǎng)狀況。
　　創(chuàng)新性：
　　1、實驗研究
　　1.1益氣養(yǎng)陰活血方為導師臨床經(jīng)驗用方，首次對其作用機制做相關實驗研究。
　　1.2從ERK通路血流動力學和非血流動力學兩方面效應探討藥