microRNA-27a在肝癌中的初步探討.pdf

1、原發(fā)性肝癌，是世界第五大常見腫瘤，死亡率高居第三，在中國則高居第二。盡管肝癌的治療手段包括化學(xué)治療、放射治療、肝臟規(guī)則性切除、肝移植及局部治療等已有了很大的進展，但肝癌病人的預(yù)后還是很差，即使根治術(shù)后5年生存率僅17％-53％，而且復(fù)發(fā)率很高。造成肝癌預(yù)后差的原因主要有兩個:其一是常規(guī)的化療對肝癌幾乎無效;其二是現(xiàn)有的早期診斷指標(biāo)存在不足，超過80％的患者就診時已處于進展期而失去最佳的手術(shù)切除機會。肝癌特異性的更早期的標(biāo)記物可以發(fā)現(xiàn)更早

2、期的病人，就會有時間提供更早的干預(yù)治療，改善病人的預(yù)后。盡管目前對肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因研究已經(jīng)有了很大的進步，但是還沒有找到解決肝癌患者更早期診斷得有效辦法，以改善預(yù)后。因此研究肝癌病例中異常表達的特異性分子標(biāo)記物，將有助于肝癌的早期發(fā)現(xiàn)病人和改善預(yù)后。
　　MicroRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類重要的基因調(diào)節(jié)分子，成熟的miRNAs是一類約19～25nt單鏈非編碼RNA分子，可通過完全或不完全特異性堿基配對與靶基因mRNA分子

3、3'UTR端相結(jié)合，通過促進靶基因mRNA的降解、調(diào)控靶基因的翻譯以及抑制靶基因的翻譯，參與細(xì)胞一系列的重要過程，包括細(xì)胞分化、增殖與凋亡，從而在生理與疾病過程中起著重要作用。越來越多的研究表明miRNAs在腫瘤組織與癌旁組織的表達具有明顯差異。miRNAs表達譜可將肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及白血病與鄰近正常組織區(qū)分開。更重要的是發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上的miRNAs定位于與腫瘤發(fā)生相關(guān)的染色體區(qū)域和脆性位點，提示miRNAs在腫瘤形成過程中可能

4、扮演著重要的角色。但是其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究還處于初級階段，因此研究與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的miRNAs表達的變化，探索肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，能夠為肝癌的早期診斷和預(yù)后預(yù)測以及篩選治療靶點提供有價值的依據(jù)。
　　本課題初步探討microRNA-27a（以下簡寫miR-27）在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。本研究共分兩部分:第一部分，我們通過TaqMan探針檢測了臨床肝癌標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本中miR-27a的表達情況;第二部分我們通

5、過生物信息學(xué)分析，研究和探討了miR-27a與其靶蛋白RYBP(RING1 and YY1 binding protein)之間的相互作用，并研究其在HCC發(fā)生發(fā)展中可能的作用機制。
　　第一部分肝癌組織與癌旁組織中miR-27a的表達情況的檢測
　　[目的]目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNAs在許多腫瘤中失調(diào)表達，miRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。已有的研究亦表明miR-23a～27a～24在肝癌組織以及與癌旁組織表達中存在差異。本研究

6、擬進一步在肝癌患者中驗證miR-27a的表達以及其單獨作為肝癌分子標(biāo)記物的可能性。
　　[方法]應(yīng)用TaqMan(@) MGB探針法定量檢測miR-27a在94例HBV陽性癌和癌周組織以及6例血管瘤旁組織中的表達，結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法，分析其在癌和癌周組織中的表達差異。同時也檢測了10種肝細(xì)胞株中miR-27a
　　[結(jié)果] miR-27a在肝癌組織與癌周組織的表達水平顯著上調(diào)(P＜0.05，paired-samples t te

7、st)。利用TaqMan(@) MGB探針法檢測miR-27a在10種肝細(xì)胞系(9種腫瘤細(xì)胞系和一種永生化的肝實質(zhì)細(xì)胞(LO2))中的表達情況。結(jié)果證實:miR-27a在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中處于高表達，顯著高于LO2，但是在高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中沒有顯著差異。
　　[結(jié)論]肝癌組織與癌旁組織之間存在miRNA差異表達， miR-27a或許可以成為一個肝癌相關(guān)的生物標(biāo)記物。
　　第二部分miR-27a生物學(xué)功能探討
　　[目的]

8、已有的研究表明miR-27a在肝癌癌組織與癌旁組織的差異表達，而相應(yīng)關(guān)于RYBP的研究表明其與miR-27a表達是負(fù)相關(guān)，前期的研究表明miR-27a可能調(diào)控RYBP。本部分主要研究miR-27a與RYBP的相互作用以及其在肝癌中的作用。
　　[方法]通過瞬時轉(zhuǎn)染pre-miR-27a，建立miR-27a過表達和干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并研究miR-27a與RYBP之間的相互作用，利用熒光素酶報告基因研究miR-27a與RYBP之間的直

9、接作用。Real-time與Western blot進一步觀察了miR-27a在調(diào)節(jié)RYBP過程中的重要作用。
　　結(jié)果:采用TargetScan5.1和Pictar網(wǎng)站預(yù)測到RYBP為miR-27a的靶基因。熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR-27a在肝癌細(xì)胞株中發(fā)生不同程度的上調(diào)，伴隨著RYBP表達量的下調(diào)，RYBP是一個Polycomb group(PcG)相關(guān)蛋白，在肝腫瘤細(xì)胞中miR-27a的表達與RYBP的表達呈負(fù)相關(guān)。我

10、們在HepG2、MHCC-97H以及MHCC-LM3細(xì)胞株中對miR-27a和RYBP的關(guān)系進行了更深入的研究。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pre-miR-27a到這三種細(xì)胞中以后，上調(diào)的miR-27a可以抑制RYBP mRNA和蛋白的表達;而轉(zhuǎn)染miR-27a的抑制序列到這兩種細(xì)胞中以后，結(jié)果顯示抑制miR-27a的表達，同時上調(diào)RYBP mRNA和蛋白的表達水平。這說明miR-27a可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)RYBP的表達。然后將RYBP基因的3'UTR克隆到

11、雙熒光素報告基因載體psi-check2的多克隆位點，觀察miR-27a的效應(yīng)，結(jié)果表明其miR-27a可以直接作用于RYBP基因的3' UTR起調(diào)控作用。
　　構(gòu)建miR-27a慢病毒表達載體，感染細(xì)胞，顯著提高細(xì)胞內(nèi)miR-27a表達水平，同時抑制RYBP mRNA和蛋白的表達，并增強了細(xì)胞的增殖能力;與之相反的是，抑制細(xì)胞內(nèi)miR-27a表達，則促進RYBP mRNA和蛋白的表達，同時抑制了細(xì)胞的增殖能力。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測

12、miR-27a對細(xì)胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-27a過表達的細(xì)胞，G0/G1期的細(xì)胞減少，S期的細(xì)胞增多。
　　[結(jié)論]以上結(jié)果證實miR-27a通過下調(diào)RYBP基因的表達，進而抑制RYBP介導(dǎo)的生長抑制以及改變細(xì)胞周期。miR-27a可以促進肝癌細(xì)胞的生長。這些結(jié)果說明在肝癌中異常表達的miR-27a通過抑制RYBP，進而改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為如細(xì)胞增殖、抗凋亡能力。綜上說明miR-27a在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮原癌基因的