microRNa-503在肝細(xì)胞肝癌中的功能及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球患者死亡率居前的惡性腫瘤，也是我國常見的惡性腫瘤之一。與其它惡性腫瘤一樣，肝癌的發(fā)生與發(fā)展是包括原癌基因激活或/和抑癌基因失活的多階段多步驟的過程。HCC的發(fā)生與慢性肝炎及肝硬化密切相關(guān)，是一個(gè)逐步發(fā)展的漸進(jìn)過程，并且HCC的發(fā)生與乙肝病毒(HBV)的感染有較高的關(guān)聯(lián)性。由于我國約有1.2億乙肝病毒攜帶者，占全球感染人數(shù)的1/3，如何有效地

2、干預(yù)HCC的發(fā)生和治療HCC患者成為了重大緊迫的問題。因此，尋找HCC的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。越來越多的研究結(jié)果證明，除了HCC內(nèi)蛋白編碼基因的變異，miRNA表達(dá)的失調(diào)也會(huì)促進(jìn)HCC的發(fā)生。
　　microRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度僅為18-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，成熟miRNA的5'非翻譯區(qū)的2-7個(gè)核苷酸的“種子序列”可以與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上抑

3、制靶基因的表達(dá)。1993年，首個(gè)microRNA-lin4被發(fā)現(xiàn)，從此揭開了對(duì)microRNA研究的序幕。隨后，許多實(shí)驗(yàn)室從線蟲、果蠅、家鼠、擬南芥及人類等多種真核生物中發(fā)現(xiàn)了至少500種這類小分子RNA，其中在人類染色體上就有300余種，占人類基因的1-4％。miRNA的編碼基因是目前最大的一類調(diào)節(jié)基因。它在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、發(fā)育和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，并與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。miRNA在腫瘤中發(fā)揮著相當(dāng)于癌基因或抑癌基因的

4、作用，調(diào)節(jié)著腫瘤細(xì)胞的多種重要的生物學(xué)行為。
　　目前發(fā)現(xiàn)很多miRNAs在肝癌中異常表達(dá)，并在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。這些異常表達(dá)的miRNA包括，miR-1、miR-21、miR-221、miR-222、miR-224, miR-301, let-7a, miR-101、miR-122、miR-125a、miR-139a、miR-143、miR-195、miR-26，miR-29和miR-199a/b-3p等。這些m

5、iRNA的失調(diào)能夠通過影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡.遷移和侵襲等生物學(xué)過程并影響HCC的發(fā)生和進(jìn)展。但是，對(duì)于失調(diào)的miRNA如何參與HCC的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步深入研究，HCC中新的失調(diào)的miRNA及其功能的探索，將為HCC的治療和預(yù)后判斷提供新的理論基礎(chǔ)。
　　目的:
　　本研究旨在尋找HCC中差異表達(dá)的miRNA，再用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法驗(yàn)證差異表達(dá)的miR-503在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并統(tǒng)計(jì)分析m

6、iR-503表達(dá)量與HCC患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步以獲得性和缺失性功能實(shí)驗(yàn)明確miR-503在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，分析并驗(yàn)證其發(fā)揮作用的直接靶基因，探索其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.利用microRNA實(shí)時(shí)定量PCR芯片技術(shù)高通量篩選肝癌細(xì)胞株和正常永生化肝臟細(xì)胞差異表達(dá)miRNA（由上?？党缮锕こ逃邢薰緟f(xié)助完成）。
　　2.進(jìn)一步用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法驗(yàn)證明顯差

7、異表達(dá)的miR-503在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。
　　收集125例肝癌患者腫瘤及周圍非瘤組織手術(shù)標(biāo)本，7株肝癌細(xì)胞系及2株永生化肝細(xì)胞系，經(jīng)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-503的表達(dá)水平。
　　3.根據(jù)miR-503在肝癌組織中的表達(dá)水平，將HCC患者分為miR-503高表達(dá)組和低表達(dá)組，進(jìn)而分析miR-503表達(dá)量與HCC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系。
　　4.

8、通過體外轉(zhuǎn)染miR-503 mimic和inhibitor的方式來進(jìn)行獲得性和缺失性功能實(shí)驗(yàn)。以CCK-8、克隆形成、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞周期檢測(cè)、Edu實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)miR-503對(duì)細(xì)胞增殖與遷移的影響。
　　5.利用在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-503可能的靶基因，并通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、Western blot等技術(shù)鑒定miR-503的靶基因。并進(jìn)一步探討miR-503參與細(xì)胞周期調(diào)控的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:

9、r>　　1.microRNA定量PCR芯片結(jié)果提示:相對(duì)于正常肝臟細(xì)胞，miR-503，miR-218，miR-424，miR-30e，miR-147，miR-450a，miR-411等在HCC細(xì)胞株中的表達(dá)下調(diào)，選擇其中表達(dá)明顯下調(diào)的miR-503做進(jìn)一步研究。
　　2.分別檢測(cè)了125例肝癌組織及配對(duì)的癌旁組織、7株肝癌細(xì)胞系及一株永生化肝細(xì)胞系L-02中miR-503的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在大部分肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中miR-50

10、3表達(dá)水平降低，差異有顯著性。
　　3.miR-503表達(dá)水平與甲胎蛋白(P=0.015)、腫瘤病理學(xué)分級(jí)(P=0.019)、TNM分期(P=0.012)及門靜脈癌栓(P=0.029)密切相關(guān)，但與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量無關(guān)，miR-503的低表達(dá)與HCC患者更短的總體生存期相關(guān)，提示miR-503可以作為一個(gè)判斷HCC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。
　　4.體內(nèi)和體外功能研究結(jié)果顯示:CCK-8實(shí)驗(yàn)、Edu實(shí)驗(yàn)、克隆形成

11、實(shí)驗(yàn)及裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-503抑制了肝癌細(xì)胞的體內(nèi)體外增殖能力;劃痕實(shí)驗(yàn)提示miR-503過表達(dá)抑制了LM3細(xì)胞的遷移。流式細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-503可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。
　　5.靶基因預(yù)測(cè)分析結(jié)果與細(xì)胞表型變化相結(jié)合，確定細(xì)胞周期相關(guān)分子cyclin D3和E2F3為候選靶基因。Western blot表明:LM3細(xì)胞中過表達(dá)miR-503明顯下調(diào)Cyclin D3和E2F3蛋白的表達(dá)，而其mRNA水平

12、無明顯變化，提示miR-503可能通過抑制靶基因的翻譯發(fā)揮作用。
　　6.構(gòu)建pmirGLO-cyclin D3-UTR和pmirGLO-E2F3-UTR野生型及突變型熒光素酶報(bào)告載體，將miR-503 mimic與野生型熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，熒光素酶報(bào)告基因活性明顯降低，而共轉(zhuǎn)染突變型熒光素酶報(bào)告載體后熒光素酶報(bào)告基因活性無明顯影響。表明miR-503過表達(dá)可直接作用于cyclin D3和E2F33'UTR的靶序

13、列，下調(diào)靶基因的表達(dá)。
　　7.miR-503過表達(dá)顯著下調(diào)Rb-E2F信號(hào)通路中關(guān)鍵分子CDK4，CDK6，磷酸化RB及E2F3下游基因cyclin A和Cdc2蛋白水平的表達(dá)，表明miR-503通過Rb-E2F信號(hào)通路抑制了肝癌細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換。
　　結(jié)論:
　　1.miR-503在HCC中表達(dá)水平頻頻下調(diào)，暗示其表達(dá)異?？赡芘cHCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　2.HCC組織中miR-503的表達(dá)水平與HC