ADLH2基因多態(tài)性對硝酸異山梨酯和單硝酸異山梨酯藥動學影響的研究.pdf

1、目的:1.采用DNA微陣列芯片法檢測從人外周血提取的DNA中線粒體乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)基因多態(tài)性，并篩選符合臨床試驗標準的受試者。
　　2.進行中國健康男性志愿者單次噴服硝酸異山梨酯噴霧劑后硝酸異山梨酯(ISDN)及其兩代謝物（2-單硝酸異山梨酯和5-單硝酸異山梨酯）藥代動力學研究，并評價ALDH2基因多態(tài)性對三者藥代動力學的影響。
　　3.進行中國健康男性志愿者單次噴

2、服單硝酸異山梨酯噴霧劑后5-單硝酸異山梨酯（5-ISMN）藥代動力學研究，并評價ALDH2基因多態(tài)性對其藥代動力學的影響。
　　4.運用分子對接軟件模擬酶與底物的作用過程，以硝酸甘油(GTN)為參考藥，從分子水平探討ALDH2基因多態(tài)性對ISDN和5-ISMN藥代動力學的影響。
　　方法:1.入組前，采集每位受試者肘靜脈血3mL，EDTA抗凝，采用血液DNA提取試劑盒，提取血樣DNA;ALDH2基因特異引物經(jīng)PCR擴增后，將

3、帶有生物素標記的擴增產(chǎn)物與固定在醛基基片上的ALDH2基因型檢測探針進行特異性雜交反應(yīng)，并通過酶促顯色反應(yīng)，使特異性雜交信號顯色;對芯片進行掃描，得到樣品DNA與ALDH2基因位點的野生型和突變型探針雜交形成的雜交圖像;經(jīng)BaiOBE-2.0生物芯片識讀儀分析該圖像，判斷待檢樣品的基因型。
　　經(jīng)查體和實驗室檢查后，篩選出20名健康男性受試者，在了解試驗內(nèi)容、權(quán)利、義務(wù)和風險的基礎(chǔ)上簽署知情同意書。
　　2.篩選出的20名健

4、康男性受試者，按基因型分為野生組和突變雜合組，單次噴服硝酸異山梨酯噴霧劑3.75mg，于給藥前和給藥后2、4、6、8、10、12、15、20、30、45min和1、1.5、2、3、4、6、8、12、24h，肘靜脈取血5mL置于試管中（肝素抗凝），5000rpm、離心5min，取上層血漿，-20℃保存待測。GC-ECD法測定血漿中ISDN、5-ISMN和2-單硝酸異山梨酯（2-ISMN）的濃度，采用DAS2.0.1藥代動力學軟件分別計算三

5、者的藥代動力學參數(shù)（t1/2、Tmax、Cmax、AUC0-t和AUC0-∞），并對兩組藥代動力學參數(shù)進行統(tǒng)計學分析（代謝物Cmax、AUC0-t和AUC0-∞采用校正值比較。參數(shù)校正值是代謝物Cmax、AUC0-t、AUC0-∞與母藥相應(yīng)藥代動力學參數(shù)的比值）。
　　3.上述受試者，單次噴服單硝酸異山梨酯噴霧劑5mg，于藥前和藥后8、15、20、30、45min、1、1.5、2、3、6、8、12、24h，肘靜脈取血5mL，置于試

6、管中（肝素抗凝），5000rpm、離心5min，取上層血漿，-20℃保存待測。GC-ECD法測定血漿中5-ISMN的濃度，采用DAS2.0.1藥代動力學軟件計算其藥代動力學參數(shù)（t1/2、Tmax、Cmax、AUC0-t和AUC0-∞），并對兩組藥代動力學參數(shù)進行統(tǒng)計學分析。
　　4.運用SYBYL-X1.1軟件，分別模擬ALDH2野生酶、ALDH2突變酶與GTN、ISDN、5-ISMN的作用過程，以GTN為參照藥，分別比較兩酶與

7、ISDN、5-ISMN的結(jié)合力。
　　結(jié)果:1.經(jīng)基因分型，本課題篩選出20名健康男性受試者，其中ALDH2基因野生型（ALDH2*1/*1）14名、突變雜合型(ALDH2*1/*2)6名。
　　2.20名受試者單次噴服硝酸異山梨酯噴霧劑3.75mg后，野生型和突變雜合型受試者體內(nèi)ISDN藥代動力學參數(shù)如下:t1/2分別為（0.994±0.309）h和（1.342±0.086）h，Tmax分別為（0.105±0.018）h和

8、（0.139±0.014）h，Cmax分別為（33.611±2.065）ng/mL和(42.615±3.003)ng/mL，AUC0-t分別為（18.999±3.798）ng/mL·h和（31.188±1.427）ng/mL·h，AUC0-∞分別為（20.915±4.383）ng/mL·h和（34.576±0.898）ng/mL·h。5-ISMN藥代動力學參數(shù)如下:t1/2分別為(4.554±0.858)h和(5.849±0.781)h

9、，Tmax分別為(0.857±0.128)h和（1.083±0.204）h，Cmax分別為（63.595±4.941）ng/mL和（83.962±5.512）ng/mL，AUC0-t分別為（286.433±72.682）ng/mL·h和（482.731±100.705）ng/mL·h，AUC0-∞分別為（300.173±68.283）ng/mL·h和(519.607±96.383)ng/mL·h;2-ISMN藥代動力學參數(shù)如下:t1/2

10、分別為（3.852±0.859）h和（3.940±0.887）h，Tmax分別為（0.470±0.148）h和（0.667±0.204）h，Cmax分別為（12.321±1.325）ng/mL和(16.647±2.530)ng/mL，AUC0-t分別為(36.501±4.564)ng/mL·h和（65.941±13.547）ng/mL·h，AUC0-∞分別為（42.407±5.402）ng/mL·h和（75.098±17.972）ng/

11、mL·h。
　　突變雜合組與野生組相比，ISDN的t1/2和Tmax分別延長42.16％(p＜0.001)和32.38％(p＜0.001)，Cmax AUC0-t和AUC0-∞分別增加26.79％(p＜0.01)、64.16％(p＜0.01)和65.32％(p＜0.01);5-ISMN的t1/1和Tmax分別延長28.44％(p＜0.05)和26.37％(p＜0.05)，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的校正值分別增加4.13

12、％(p＞0.05)、2.67％(p＞0.05)和4.71％(p＞0.05);2-ISMN的t1/2和Tmax分別延長2.28％(p＞0.05)和41.91％(p＞0.05)，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的校正值分別增加6.56％(p＞0.05)、10.05％(p＞0.05)和7.12％(p＞0.05)。
　　3.20名受試者單次噴服單硝酸異山梨酯噴霧劑5mg后，野生型和突變雜合型受試者體內(nèi)5-ISMN藥代動力學參數(shù)如下:t

13、1/2分別為（4.981±1.248）h和（5.365±0.824）h，Tmax分別為（0.821±0.117）h和（0.833±0.119）h，Cmax分別為（109.332±5.668）ng/mL和（114.108±4.529）ng/mL，AUC0-t分別為（607.626±68.854）ng/mL·h和（658.459±89.621）ng/mL·h，AUC0-∞分別為(634.798±83.358)ng/mL·h和(690.937

14、±105.191)ng/mL·h。
　　突變雜合組與野生組相比，t1/2和Tmax分別延長了7.72％(p＞0.05)和1.45％(p＞0.05)，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞分別增加4.37％(p＞0.05)，8.37％(p＞0.05)和8.84％(p＞0.05)。
　　4.SYBYL-X1.1軟件對ALDH2野生酶與GTN、ISDN、5-ISMN作用過程的打分分別為6.49、5.45和3.41，對ALDH2突變酶

15、與GTN、ISDN、5-ISMN作用過程的打分分別為3.82、2.42和3.22。
　　結(jié)論:研究結(jié)果表明，ALDH2基因多態(tài)性影響ISDN的人體藥代動力學。噴服硝酸異山梨酯噴霧劑后，與野生組相比，突變雜合組ISDN的t1/2、Tmax、Cmax、AUC0-t和AUC0-∞都增加，且差異具有統(tǒng)計學意義;與野生組相比，突變雜合組5-ISMN的t1/2和Tmax都增加，且差異有統(tǒng)計學意義，而其它藥動學校正參數(shù)間的差異無統(tǒng)計學意義;但兩