移植物抗宿主病的預(yù)后分析及前列腺素E-,2-對(duì)CD4+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的：研究體外培養(yǎng)條件下PGE2對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)表達(dá)譜基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)新的靶基因，通過(guò)ELISA、流式細(xì)胞術(shù)以及免疫印記等方法檢測(cè)下游產(chǎn)物，進(jìn)一步闡明PGE2調(diào)節(jié)CD4+細(xì)胞免疫功能的作用機(jī)理。 方法：①分離健康志愿者捐獻(xiàn)的白膜，應(yīng)用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用CD4+單克隆抗體標(biāo)記的免疫磁珠分離純化CD4+T細(xì)胞。②在13umol/L濃度的PGE2條件下，應(yīng)用抗CD3和抗CD28單克隆抗體作為

2、刺激劑，將純化的CD4+T細(xì)胞體外培養(yǎng)12h。收集細(xì)胞后提取RNA，進(jìn)行表達(dá)譜基因芯片檢測(cè)，并應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。③分析芯片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有意義的基因，應(yīng)用ELISA、流式細(xì)胞術(shù)及免疫印記等方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。 結(jié)果：⑴流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，應(yīng)用免疫磁珠分選的CD4+T細(xì)胞純度≥99％。表達(dá)譜基因芯片結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，應(yīng)用13umol/L濃度的PGE2作用12小時(shí)后，CD4+T細(xì)胞基因表達(dá)以下調(diào)為

3、主，即以倍數(shù)變化1.5倍為準(zhǔn)，表達(dá)上調(diào)的基因有73個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有1716個(gè)，涉及的信號(hào)途徑主要有腫瘤壞死因子α(TNF-α)與核因子—kB(NF—kB)信號(hào)途徑、T細(xì)胞受體信號(hào)途徑、白細(xì)胞介素2(IL—2)信號(hào)途徑、MAPK信號(hào)途徑等。⑵ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清的細(xì)胞因子濃度，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，干擾素γ(IFN—γ)與TNF-α濃度明顯下降。在培養(yǎng)后24、48、72小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組IFN—γ濃度分別為0、(2.3±4

4、.7)pg/ml、(10.9±4.7)pg/ml，對(duì)照組分別為(399.6±332.1)pg/ml、(842.8±479.7)pg/ml、(2963.1±644.9)pg/ml，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在培養(yǎng)后48小時(shí)和72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組TNF-α濃度分別為113.5±57.3)pg/ml、(189.7±32.0)pg/ml，對(duì)照組分別為(1093.7±353.3)pg/ml、(1627.2±498.6)pg/ml，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但

5、對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IL—2濃度均低于試劑盒檢測(cè)閾值。⑶流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較，CD4+T細(xì)胞CD25、CD69、HLA—DR、CD40等表面抗原表達(dá)率下降。 結(jié)論：①在體外培養(yǎng)條件下，PGE2對(duì)CD4+T細(xì)胞的基因表達(dá)具有明顯調(diào)節(jié)作用，并且以負(fù)性調(diào)節(jié)為主，表達(dá)有差異的基因以免疫相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)途徑為主。②PGE2作用于CD4+T細(xì)胞，明顯下調(diào)介導(dǎo)GVHD的細(xì)胞因子的分泌，并下調(diào)與CD4+T細(xì)胞免疫激活和