不同微載體懸浮培養(yǎng)對人脂肪前體細(xì)胞貼壁、增殖與分化的影響.pdf

1、目的:自體脂肪顆粒注射移植由于其沒有免疫排斥、無瘢痕、可以一舉兩得等優(yōu)點，成為一種前景十分廣闊的組織填充方法。但移植脂肪低存活率的問題自一開始便一直困擾著臨床工作者。促進脂肪前體細(xì)胞的增殖與分化，是提高顆粒脂肪移植存活率的關(guān)鍵之一。微載體懸浮培養(yǎng)是目前公認(rèn)的較有發(fā)展前途的一種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，可以促進細(xì)胞的增殖與分化，并且可用于注射，無明顯瘢痕形成，因此成為脂肪組織工程理想的載體形式，為問題的解決帶來

2、了希望。微載體種類繁多，所采用的材料及制作工藝對其性能均有影響；總體上講，理想的組織工程支架尚未發(fā)現(xiàn)。本文旨在通過比較不同微載體對脂肪前體細(xì)胞黏附、增殖與分化的影響，以期找到一種較好的微載體或較好的微載體屬性，指導(dǎo)臨床應(yīng)用。 方法：在自制的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)中，采用PLGA光滑、PLGA粗糙和PLGA/PEG共混粗糙三種不同微載體進行脂肪前體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，以普通單層培養(yǎng)作為對照。 1).注射器抽吸的方法吸取腹部皮下脂肪組織，膠

3、原酶消化法分離得到脂肪前體細(xì)胞，體外單層培養(yǎng)、擴增； 2).脂肪前體細(xì)胞的確認(rèn)：觀察細(xì)胞在增殖期和分化期的不同形態(tài)，計算細(xì)胞倍增時間，油紅O染色確認(rèn)脂肪細(xì)胞的分化，并與成纖維細(xì)胞對比； 3).細(xì)胞黏附情況比較：停止轉(zhuǎn)動數(shù)分鐘，待微載體沉降后吸取上清液計數(shù)細(xì)胞，計算貼壁率，繪制細(xì)胞在不同微載體上的貼壁率曲線； 4).細(xì)胞增殖情況比較：用倒置顯微鏡觀察，用CCK法計數(shù)細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長曲線，計算并比較細(xì)胞倍增時間；

4、 5).細(xì)胞分化情況比較：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，油紅O染色觀察胞內(nèi)脂滴。定量測定并比較脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)志物：油紅O染色后用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的含量，測定脂肪細(xì)胞分化特異性酶G-3-PDH的活性； 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0軟件對結(jié)果行單因素方差分析(ANOVA)，PostHoc檢驗，P＜0.05為有顯著差異。 結(jié)果： 1).貼壁開始的3h內(nèi)，PLGA粗糙微載體(PLGAr)與

5、PLGA/PEG共混微載體(PLGA/PEG)的細(xì)胞貼壁率明顯高于PLGA光滑微載體(PLGAs)，但持續(xù)轉(zhuǎn)動后較易波動，12h后細(xì)胞在三種微載體表面的黏附率均達(dá)到90％左右，24h后貼壁率無明顯差異； 2).與普通單層培養(yǎng)相比，三種微載體懸浮培養(yǎng)明顯表現(xiàn)出更塊的增殖速度和更大的增殖能力，不同微載體上細(xì)胞倍增時間無明顯差異； 3).與普通單層培養(yǎng)相比，微載體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞分化更好，胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增多，形態(tài)飽滿，不同微載體間無

6、明顯差異； 4).所謂PLGA光滑微載體實為納米表面形貌，而PLGA粗糙微載體、PLGA/PEG共混粗糙微載體為微米表面形貌。 結(jié)論： 1.相對于普通單層培養(yǎng)，微載體懸浮培養(yǎng)可以獲得更快的增殖速度、更大的增殖倍數(shù)、更好的分化，可以用于快速獲取大量脂肪前體細(xì)胞； 2.PLGAs、PLGAr與PLGA/PEG三種微載體均可用于脂肪前體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，三種微載體均無細(xì)胞毒性，對細(xì)胞分化無不良影響； 3.粗