E抗原陽性慢性乙型肝炎經(jīng)治患者干擾素的應(yīng)答及其信號通路研究.pdf

1、目的：
　　我國是乙肝大國，慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）患者人數(shù)眾多，由其導(dǎo)致的終末期肝病嚴(yán)重威脅人們健康。有效的抗病毒治療可以減少肝纖維化、肝硬化、肝癌等并發(fā)癥的發(fā)生，顯著改善預(yù)后。目前乙肝抗病毒治療的藥物主要分為兩大類，一類為核苷類似物（Nucleotide Analogues,NAs），在我國使用的NAs主要有4種：拉米夫定（LAM），阿德福韋酯（ADV），替比夫定(LDT)，恩替卡韋（ET

2、V）。另一類藥物為干擾素(IFN),包括普通IFN和長效IFN（Peg-IFN）。NAs和IFN作用特點(diǎn)各有不同：NAs抑制病毒復(fù)制的作用很強(qiáng)，同時(shí)口服給藥，攜帶使用方便，副作用較小。缺點(diǎn)是較難獲得理想的治療終點(diǎn)，即HBeAg/HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換或者HBsAg的清除，同時(shí)停藥后容易復(fù)發(fā)。另外NAs需要長時(shí)間服藥，易導(dǎo)致耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。IFN的治療優(yōu)勢是有限療程（一般12個(gè)月，有的可以延長到18個(gè)月），以及高的HBeAg/HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)

3、換率和清除率，獲得持久的免疫學(xué)控制，停藥后復(fù)發(fā)率低。缺點(diǎn)是使用較為復(fù)雜，副作用較多，同時(shí)病毒自身可進(jìn)化并開發(fā)出各種策略抑制IFN相關(guān)信號通路的活化，導(dǎo)致IFN使用效率降低。CHB患者的優(yōu)化/個(gè)體化治療已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)有很多學(xué)者嘗試?yán)肐FN和NAs這兩類藥物各自的優(yōu)勢，采用更好的治療方案，例如聯(lián)合，序貫治療，以獲得更好的臨床治療效果。
　　從IFN的分子機(jī)制來說，在乙肝抗病毒治療中它是唯一同時(shí)具有抗病毒和直接免疫調(diào)節(jié)作

4、用的藥物。體外研究表明：IFN抗病毒效應(yīng)是通過如下機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，IFN進(jìn)入體內(nèi)后首先與細(xì)胞表面IFN受體結(jié)合，活化多種信號分子，例如STAT1（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活分子1）,進(jìn)而激活經(jīng)典的JAK/STAT信號通路，誘導(dǎo)下游抗病毒效應(yīng)基因的產(chǎn)生而發(fā)揮抗病毒作用。在這些效應(yīng)基因中，以抗粘液病毒蛋白（MxA），2‘,5‘-寡腺苷酸合成酶（2‘,5‘-OAS）,蛋白激酶R（PKR）等最為重要。MxA是IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的分布于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，具有廣譜

5、的抗病毒活性，對正黏病毒、棒狀病毒、小RNA病毒及乙肝病毒均有強(qiáng)大的抑制作用。而2‘,5‘-OAS可以啟動(dòng)核酸水解酶，通過選擇性地降解病毒RNA來發(fā)揮抑制病毒的作用。JAK/STAT通路存在一些負(fù)性調(diào)控基因來抑制其活化，在IFN激活JAK/STAT通路的同時(shí)，這些負(fù)性調(diào)控基因也會(huì)通過負(fù)反饋被激活，來避免信號通路的過度活化。在這些負(fù)性調(diào)控因子中，以SOCS3(細(xì)胞因子信號通路抑制分子3)、PIAS（STAT1激活抑制蛋白）等最為重要。SO

6、CS3能通過結(jié)合磷酸化的細(xì)胞因子受體,使JAKs失活,抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。相比較而言,PIAS更像緩沖劑,通過控制活化STAT的數(shù)量來調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。
　　在慢性乙型肝炎治療中，IFN應(yīng)答率并不高，說明IFN抵抗的情況可能出現(xiàn)在慢性乙肝患者治療中。同時(shí)IFN在治療慢性乙型肝炎過程中發(fā)揮抗病毒，免疫調(diào)節(jié)作用以及病毒抵抗IFN的分子機(jī)制尚未完全闡明。OSST臨床研究是一項(xiàng)在HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者中使用Peg-IFN-α和ETV聯(lián)合

7、或序貫治療以優(yōu)化血清學(xué)轉(zhuǎn)換的研究，本文的研究對象為一部分來自O(shè)SST臨床試驗(yàn)的患者。我們將患者臨床應(yīng)答情況與IFN的信號通路研究相結(jié)合，觀察不同臨床結(jié)局患者外周血和肝組織中相關(guān)信號分子的表達(dá)情況，并進(jìn)一步比較其差異。研究結(jié)果為使用NAs治療的CHB患者優(yōu)化治療策略提供了新的理論依據(jù)。同時(shí)深化了對IFN治療CHB患者相關(guān)分子機(jī)制以及病毒抵抗機(jī)制的理解，為進(jìn)一步尋找IFN治療相關(guān)預(yù)測指標(biāo)以及靶點(diǎn)提供了新的研究思路。
　　本研究內(nèi)容如下

8、：
　　1.將E抗原陽性慢性乙型肝炎經(jīng)治患者（使用ETV治療，并獲得持續(xù)病毒學(xué)控制的患者）隨機(jī)分為兩組，A組序貫使用IFN治療，B組繼續(xù)使用ETV治療。同時(shí)在治療過程中觀察相關(guān)臨床指標(biāo)HBV DNA、HBeAg、HBsAg、ALT的動(dòng)態(tài)變化，并比較48周，96周時(shí)兩組間總應(yīng)答率(HBeAg/HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，HBsAg清除)的差異，以期望能發(fā)揮兩種藥物各自的優(yōu)勢，使患者獲得更加理想的治療終點(diǎn)。
　　2.觀察患者PBMC和

9、肝組織中IFN相關(guān)信號通路分子治療過程中的動(dòng)態(tài)變化并比較組間（有應(yīng)答和無應(yīng)答組）差異，同時(shí)結(jié)合臨床應(yīng)答，嘗試建立兩者間的聯(lián)系。
　　方法：
　　1.基于上述研究背景，選取同濟(jì)醫(yī)院單中心的E抗原陽性慢性乙型肝炎經(jīng)治患者（這些患者屬于OSST臨床研究中的一部分）。入組標(biāo)準(zhǔn)為已使用ETV治療9-36月，HBV DNA陰性但未發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。按照隨機(jī)分組的原則將患者分到A組和B組，每組各27名患者。A組使用Peg-IFN規(guī)

10、范治療一年(初始8周使用ETV+IFN聯(lián)合治療)，治療結(jié)束后繼續(xù)隨訪一年，B組繼續(xù)使用ETV治療。治療過程中動(dòng)態(tài)觀察臨床相關(guān)指標(biāo)的變化，并在48周，96周時(shí)比較兩組間總應(yīng)答率的差異。
　　2.為了深入研究IFN信號通路以及其下游的抗病毒效應(yīng)分子和治療應(yīng)答的關(guān)系，收集了本中心A，B兩組各27名慢性乙型肝炎患者不同時(shí)間點(diǎn)（0、4、12、24、36、48、72、96周）的外周血標(biāo)本并分離PBMC，將PBMC分別提取RNA和蛋白。使用Re

11、al Time PCR檢測PBMC中STAT1，MxA，2‘,5‘-OAS和SOCS3在治療過程中的動(dòng)態(tài)變化情況，同時(shí)使用Western-Blot方法檢測了IFN信號通路關(guān)鍵分子磷酸化STAT1的表達(dá)。
　　3.收集了部分A組患者治療前后（0，48周）肝組織標(biāo)本，采用Real Time PCR方法檢測了治療前后STAT1，MxA，2‘,5‘-OAS以及SOCS3的表達(dá)，同時(shí)用免疫組織化學(xué)（IHC）的方法檢測了肝組織中磷酸化的STA

12、T1以及SOCS3在治療前后的表達(dá)情況，以進(jìn)一步明確IFN治療前后信號通路關(guān)鍵分子，負(fù)性調(diào)控基因與治療結(jié)局之間的聯(lián)系。
　　結(jié)果:
　　1.A，B兩組患者基線特征無差異。A組內(nèi)有應(yīng)答患者和無應(yīng)答患者基線HBsAg有顯著差異，治療過程中A組患者HBsAg的下降幅度顯著高于B組，A組內(nèi)有應(yīng)答患者HBsAg治療過程中下降幅度顯著高于無應(yīng)答患者。在48周，96周時(shí)，A組的總應(yīng)答率(HBeAg/HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，HBsAg清除)高

13、于B組（22.2％vs3％，37％vs3％）。
　　2.A組患者在使用IFN治療后，PBMC中STAT1，MxA，2‘,5‘-OAS，SOCS3的mRNA水平均有增高，而使用NAs治療的B組患者PBMC中這些分子的表達(dá)沒有明顯變化。進(jìn)一步在A組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，A組內(nèi)應(yīng)答和未獲得應(yīng)答患者PBMC中基線SOCS3的mRNA水平有顯著差異。與基線相比較，A組有應(yīng)答患者PBMC中4周時(shí)STAT1和4周，12周時(shí)MxA的mRNA增長幅度顯著高于

14、未獲得應(yīng)答的患者。和基線相比較，4周時(shí)磷酸化STAT1蛋白水平的增長幅度在A組有應(yīng)答和無應(yīng)答患者間有顯著差異。HBsAg的下降幅度（0周-48周）分別和STAT1，MxA的mRNA增長幅度（STAT14周/0周，MxA12周/0周）正相關(guān)。
　　3.A組患者肝組織磷酸化STAT1免疫組化染色結(jié)果顯示：未獲得應(yīng)答者基線磷酸化STAT1的表達(dá)顯著高于有應(yīng)答患者，有應(yīng)答患者48周時(shí)磷酸化的STAT1表達(dá)較基線相比明顯上調(diào)，無應(yīng)答患者48

15、周時(shí)磷酸化STAT1的表達(dá)水平未見明顯變化。和基線相比，有應(yīng)答患者48周STAT1，MxA的mRNA水平增長幅度顯著高于無應(yīng)答患者。有應(yīng)答患者48周時(shí)SOCS3的mRNA水平的上調(diào)幅度顯著低于無應(yīng)答患者，SOCS3免疫組化染色結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。
　　結(jié)論:
　　1.在NAs治療取得了持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答，但未出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換的慢性乙肝患者，轉(zhuǎn)換為序貫使用IFN治療可以有效提高此類患者的血清學(xué)轉(zhuǎn)換率，獲得理想的治療終點(diǎn)。從研

16、究結(jié)果來看，這種序貫治療方案治療效果優(yōu)于繼續(xù)單用NAs治療。
　　2.在PBMC中的研究表明：IFN信號通路中的STAT1分子，下游抗病毒蛋白MxA mRNA水平早期的增長幅度以及SOCS3的基線水平和患者的治療結(jié)局有關(guān)，STAT1和MxA的增長幅度和治療過程中HBsAg的下降程度正相關(guān)，提示這些基因一定程度上可以預(yù)測IFN的療效。
　　3.肝組織中研究表明：基線磷酸化STAT1水平較高的患者對IFN治療的應(yīng)答較差，48周時(shí)