環(huán)境雌激素DBP圍生期暴露對(duì)未成熟腦的神經(jīng)毒性及其機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了詳細(xì)論述：
　　第一部分圍生期DBP暴露對(duì)不同發(fā)育期子代大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的影響.
　　目的:在本課題組前期研究已證實(shí)500mg/(kg.d) DBP圍生期暴露對(duì)子代大鼠的學(xué)習(xí)記憶有影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察該劑量DBP圍生期暴露對(duì)不同發(fā)育期子代大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的影響，并探討其是否具有年齡、性別差異性，以及發(fā)育早期停止暴露后DBP對(duì)成年仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞是否仍然有影響。
　　方法:SD孕鼠從孕第6天至產(chǎn)

2、后21天給予500mg/(kg.d) DBP或同等容積玉米油（正常對(duì)照組）灌胃染毒，仔鼠21天斷乳后正常喂養(yǎng)，分別于仔鼠生后5天、21天、60天取海馬檢測(cè)以下指標(biāo):①尼氏染色觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞存活情況;②透視電鏡觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);③原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)海馬凋亡細(xì)胞;④Annexin V-PI雙參數(shù)流式細(xì)胞法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡和凋亡情況;⑤酶標(biāo)儀法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3活性。
　　結(jié)果:①尼氏染色:給

3、藥組5天及21天仔鼠海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞輪廓不清或溶解，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組明顯減少，雌雄無差異;與正常對(duì)照組仔鼠比較，給藥組5天雌雄仔鼠神經(jīng)細(xì)胞減少比例分別高達(dá)13.4％和15.3％，給藥組21天雌雄仔鼠神經(jīng)細(xì)胞減少比值分別為7.9％和4.7％，表明DBP圍生期暴露導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞丟失，且新生鼠較幼年鼠更明顯;而給藥組60天仔鼠與對(duì)照組比較雖然有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②透視電鏡:給藥組21天的雌、雄仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞均出現(xiàn)

4、線粒體腫脹、空泡化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張改變;給藥組60天的雌、雄仔鼠神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見明顯異常改變。③TUNEL法檢測(cè)海馬細(xì)胞凋亡:給藥組5天、21天仔鼠海馬凋亡細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多，而給藥組60天仔鼠與對(duì)照組比較無顯著差異，雌雄仔鼠間凋亡細(xì)胞無差異。④Annexin V-PI法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡和凋亡情況:給藥組5天雌雄仔鼠海馬死亡細(xì)胞比例均較對(duì)照組增高，P＜0.01;給藥組5天、21天仔鼠海馬凋亡細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯增高，雌雄無差異，P

5、均＜0.001。與同齡同性別正常對(duì)照比較，給藥組5天雌雄仔鼠凋亡細(xì)胞增加比值分別高達(dá)278.4％和376.4％，而給藥組21天雌雄仔鼠增加比值分別為169.8％和159.1％，表明DBP圍生期暴露導(dǎo)致的海馬細(xì)胞過度凋亡新生鼠較幼年鼠更明顯。給藥組60天仔鼠海馬凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組比較有增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑤海馬神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3活性檢測(cè):給藥組5天、21天仔鼠海馬Caspase-3活性均較對(duì)照組明顯增高，雌雄間無差異;與同齡同

6、性別正常對(duì)照比較，給藥組5天雌雄仔鼠海馬細(xì)胞caspase-3活性增加比值分別高達(dá)130.1％和166.1％，而給藥組21天雌雄仔鼠增加比值分別為39.6％和38.2％，再次表明DBP圍生期暴露導(dǎo)致的海馬細(xì)胞過度凋亡新生鼠較幼年鼠更明顯;給藥組60天仔鼠與對(duì)照組比較無顯著差異。
　　結(jié)論:①500mg/(kg·d)DBP圍生期染毒可導(dǎo)致新生鼠和幼年鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞壞死和過度凋亡，年齡越小，損害越重，這可能是DBP導(dǎo)致發(fā)育期大鼠學(xué)習(xí)記

7、憶功能障礙的原因之一。②DBP對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的毒性效應(yīng)未見明顯性別差異。③發(fā)育早期脫毒后，DBP未對(duì)成年腦海馬神經(jīng)細(xì)胞造成明顯損傷。
　　第二部分圍生期DBP暴露對(duì)未成熟期子代大鼠海馬突觸的影響。
　　目的:觀察DBP圍生期暴露對(duì)未成熟期子代大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)和功能的影響，并分析性別差異性及發(fā)育早期脫毒后的變化。
　　方法:模型建立及分組方法同第一部分，分別于仔鼠生后21天、60天取海馬進(jìn)行檢測(cè):①免疫組化及Wester

8、n blot方法分析子代大鼠海馬突觸素的表達(dá)變化。②電鏡觀察海馬突觸超微結(jié)構(gòu)。⑧觀察海馬突觸CA1區(qū)長時(shí)程增強(qiáng)的變化。
　　結(jié)果:①海馬突觸素表達(dá):正常對(duì)照組60天雌雄仔鼠的海馬突觸素表達(dá)較21天同性別仔鼠明顯增高，P均＜0.001;給藥組21天仔鼠海馬突觸素表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，雌雄無差異，P均＜0.01;而給藥組60天仔鼠突觸素表達(dá)與對(duì)照組比較雖有降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu):與對(duì)照組比較，給藥組21天雌雄仔鼠

9、海馬突觸均呈現(xiàn)出數(shù)量減少、突觸前囊泡減少、突觸后致密物變薄的變化趨勢(shì)，而給藥組60天仔鼠海馬突觸無明顯類似改變。③海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞突觸長時(shí)程增強(qiáng)的變化:無論雌雄，HFS后正常對(duì)照組60天仔鼠fEPSP的斜率和幅度變化均較正常對(duì)照組21天仔鼠增高，P均＜0.05;給藥組21天雌雄仔鼠HFS后的fEPSP斜率及幅度變化均較對(duì)照組顯著降低;而給藥組60天仔鼠HFS后的fEPSP的斜率和幅度變化與正常對(duì)照組比較同樣有所下降，但仍然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

10、異。各組間雌雄無差異。
　　結(jié)論:①500mg/(kg·d)DBP圍生期暴露可明顯損害幼年子代大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)和突觸傳遞效能，無性別差異性，這可能是DBP導(dǎo)致發(fā)育期子代大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的另一個(gè)重要原因。②500mg/(kg·d)DBP圍生期暴露仔鼠成年后的海馬突觸結(jié)構(gòu)及突觸傳遞效能雖有輕微異常，但與正常對(duì)照比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示發(fā)育早期脫離污染后，DBP對(duì)成年腦海馬突觸沒有明顯影響。
　　第三部分圍生期DBP暴露致子代

11、大鼠神經(jīng)毒性的可能機(jī)制。
　　目的:觀察DBP暴露后子代大鼠的血清性激素水平變化、海馬AROM及ER-β的表達(dá)水平，以及與ER-β信號(hào)途經(jīng)相關(guān)的兩個(gè)重要蛋白p-CREB、BDNF的表達(dá)變化，探討DBP神經(jīng)毒性可能機(jī)制。
　　方法:模型建立及分組方法同第一部分，分別于仔鼠生后21天、60天取血清和海馬進(jìn)行檢測(cè):①化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測(cè)子代大鼠血清中的睪酮和雌二醇水平;②采用免疫組化及Western blot方法分析子代大鼠海馬

12、AROM、ER-β、p-CREB、BDNF的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:①血清性激素水平變化:給藥組21天、60天雄鼠及21天雌鼠血清睪酮水平較同齡對(duì)照組低，而21天、60天雌雄大鼠雌激素水平均較對(duì)照組增高。②海馬AROM、ER-β、p-CREB、BDNF表達(dá)的變化:與對(duì)照組仔鼠比較，給藥組21天仔鼠的AROM的表達(dá)增高，而ER-β、p-CREB、BDNF的表達(dá)均降低，雌雄無顯著差異;而給藥組60天仔鼠各指標(biāo)與對(duì)照組比較無顯著差異。

13、r>　　結(jié)論:①DBP圍生期暴露降低了雌雄子代大鼠的睪酮水平，且雄性子代大鼠的睪酮降低持續(xù)至成年期;而幼年雌雄子代大鼠血清雌激素水平均增高，一直持續(xù)至成年。②DBP圍生期暴露上調(diào)了幼年子代大鼠海馬AROM表達(dá)，而抑制了ER-β、p-CREB及BDNF的表達(dá)。血清睪酮水平的降低及海馬腦區(qū)ER-β的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致p-CREB依賴性BDNF雌激素效應(yīng)的降低，可能是DBP導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性及突觸可塑性損害的關(guān)鍵原因。③DBP對(duì)海馬AROM、ER