皂角苷佐劑對(duì)大菱鲆重要免疫基因的表達(dá)及非特異免疫的影響.pdf

1、細(xì)菌性疾病是威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類健康的主要原因之一。長(zhǎng)期以來(lái),采用化學(xué)制劑和抗生素類藥物治療魚(yú)病,不僅病原菌耐藥性增強(qiáng),還會(huì)使魚(yú)體藥物殘留而對(duì)人類造成間接地傷害。魚(yú)類疾病控制正在向用魚(yú)用疫苗放置方向發(fā)展。魚(yú)病的疫苗免疫防治技術(shù)是最佳的魚(yú)病防治策略,但魚(yú)類的特殊生活環(huán)境,注射和口服免疫接種的方式都不是最優(yōu)途徑,浸泡則成為魚(yú)用疫苗的首選。為了增強(qiáng)浸泡疫苗的免疫保護(hù)效果,本研究以前期篩選出的皂角苷為佐劑,以甲醛滅活鰻弧菌疫苗,以大菱鲆為實(shí)驗(yàn)魚(yú)類,

2、從魚(yú)類非特異性免疫和特異性免疫兩個(gè)方面,對(duì)皂角苷的佐劑功能進(jìn)行評(píng)價(jià),以期從分子水平上闡明皂角苷佐劑的免疫機(jī)理。
　　第一部分,以不同濃度的皂角苷(15mg/L、35 mg/L)為佐劑,用滅活鰻弧菌為浸泡疫苗免疫大菱鲆,采用腹腔注射為陽(yáng)性對(duì)照組,對(duì)免疫后不同時(shí)間段內(nèi)各主要免疫器官(皮膚、鰓、頭腎、脾臟和腸組織)中各主要免疫相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明,在兩組皂角苷佐劑聯(lián)合浸泡疫苗組的大菱鲆的鰓組織中,MHCⅡα基因在浸泡

3、的4~8 h內(nèi),即表現(xiàn)出顯著的表達(dá),相對(duì)表達(dá)量分別為136.3和378.5,1d后表達(dá)量迅速降低。高濃度的皂角苷組及皂角苷聯(lián)合疫苗浸泡組在浸泡8 h時(shí)的大菱鲆皮膚中,MHCⅡα基因的相對(duì)表達(dá)量即可出現(xiàn)顯著提高,相對(duì)表達(dá)量47.1和41.9,3~15d內(nèi),皮膚中MHCⅡα基因的相對(duì)表達(dá)量最高的一組出現(xiàn)在低濃度皂角苷(15mg/L)聯(lián)合疫苗浸泡組,表達(dá)量為57.6。浸泡1 d后,脾臟中MHCⅡα基因相對(duì)表達(dá)最高的組出現(xiàn)在注射對(duì)照組中,且該基

4、因的高相對(duì)表達(dá)量在脾臟持續(xù)至15 d。在脾臟中,浸泡3 d~15 d內(nèi)低濃度皂角苷聯(lián)合疫苗浸泡組的MHCⅡα基因呈現(xiàn)次高相對(duì)表達(dá)量,僅次于注射組,顯著高于其他各組(P<0.05),在頭腎中,浸泡后的第3 d,兩組皂角苷聯(lián)合疫苗浸泡組的MHCⅡα基因呈現(xiàn)高相對(duì)表達(dá)量,兩組表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。而在注射組中,頭腎的MHCⅡα基因表達(dá)從浸泡后的第3 d開(kāi)始,到第15 d時(shí)呈現(xiàn)最高值,相對(duì)表達(dá)量分別到達(dá)6.37,顯著高于其他各組(P<

5、0.05)。對(duì)IL-1β基因在皮膚、鰓、頭腎、脾臟和腸中的表達(dá)分析結(jié)果顯示,皮膚中IL-1β表達(dá)的最高值,出現(xiàn)在佐劑聯(lián)合疫苗組,其中低濃度組(15mg/L)比高濃度組(35mg/L)的表達(dá)高,二者顯著高于其他組(P<0.05),相對(duì)表達(dá)量分別為14.01和11.02。IL-1β與MHCⅡα在皮膚中的表達(dá)趨勢(shì)相同,鰓中IL-1β表達(dá)的最高值,同樣出現(xiàn)在佐劑聯(lián)合浸泡疫苗組,分別達(dá)到21.58和32.58,且顯著高于其他各組(P<0.05)。

6、頭腎和脾臟組IL-1β表達(dá)的最高值都出現(xiàn)在4 h的注射組,表達(dá)量分別是169.53和222.1,顯著高于其他各組(P<0.05)。頭腎和脾臟兩個(gè)組織中,佐劑聯(lián)合疫苗組表達(dá)優(yōu)于其他各組,但差異不顯著(P>0.05)。腸中IL-1β的的表達(dá)的最高值仍然出現(xiàn)在注射組,表達(dá)量為24.51,次高組為高濃度佐劑聯(lián)合浸泡疫苗組,表達(dá)量達(dá)到20.02。TNF-α在皮膚中的表達(dá)高峰出現(xiàn)在7d的低濃度佐劑加疫苗組,其他各組差異不顯著。鰓中的表達(dá)量最高出現(xiàn)在

7、7d注射組,同時(shí)間佐劑加疫苗組的表達(dá)是次高值。佐劑加疫苗組的腸中TNF-α的表達(dá)在8 h時(shí)出現(xiàn)明顯上調(diào),顯著高于其他各組,而15 d的注射組才開(kāi)始上調(diào)。脾臟中TNF-α表達(dá)只有注射組在7 d時(shí)顯著升高是其他各組的近百倍。頭腎中的最高值出現(xiàn)在單佐劑組,而注射組在整個(gè)事件段都顯示出明顯優(yōu)勢(shì)。
　　對(duì)大菱鲆背腹面不同分區(qū)的皮膚進(jìn)行三種基因表達(dá)分析表明,MHCⅡα基因表達(dá)量最高的出現(xiàn)在鰓蓋下方皮膚,達(dá)到6.56。其次是尾部側(cè)線達(dá)到6.31

8、,腹面抗原呈遞效果不明顯。IL-1β和TNF-α基因的表達(dá)趨勢(shì)與MHCⅡα的相同。
　　結(jié)果表明,皂角苷聯(lián)合鰻弧菌疫苗浸泡免疫大菱鲆后,可以顯著提高疫苗抗原在皮膚等組織中呈遞,同時(shí)引發(fā)相應(yīng)組織的炎癥反應(yīng)。
　　本文第二部分評(píng)價(jià)了皂角苷增強(qiáng)魚(yú)類非特異免疫效果,分別用濃度為0、15和35 mg/L的皂角苷浸泡大菱鲆,分析了浸泡后6、12、24、48和72 h時(shí)大菱鲆白細(xì)胞的吞噬活力、血清補(bǔ)體旁路途徑溶血活性、血清與黏液中溶菌酶活

9、性、抑菌活性與堿性磷酸酶活性及血清總蛋白濃度。結(jié)果顯示,皂角苷低濃度組(15 mg/L)與高濃度組(35 mg/L)大菱鲆白細(xì)胞吞噬活力分別在浸泡后12 h與24 h出現(xiàn)顯著的增高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組大菱鲆血清中補(bǔ)體旁路途徑溶血活性除低濃度組在12 h與24 h較對(duì)照組低外,其他檢測(cè)時(shí)段均高于對(duì)照組(P<0.05)。血清溶菌酶活性最高值出現(xiàn)在低濃度組浸泡后6h時(shí),黏液中未能檢測(cè)出。不同時(shí)間點(diǎn)各組大菱鲆黏液抑菌活力變化幅度較大,兩實(shí)驗(yàn)

10、組黏液抑菌活力在浸泡后6h與12h時(shí)較對(duì)照組提高,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組間無(wú)差異(P>0.05)。血清中AKP活力高峰值出現(xiàn)在浸泡后6 h與12 h,該時(shí)段AKP的活力顯著高于對(duì)照組,且實(shí)驗(yàn)組間存在差異(P<0.05),而黏液中AKP高峰值出現(xiàn)在12 h,該時(shí)段AKP的活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組間無(wú)差異。浸泡皂角苷后6 h高濃度組血清中蛋白濃度達(dá)到最高值,除12 h時(shí)各組差異不顯著外(P>0.05),24 h~72 h高濃度組中血清