柞蠶免疫相關(guān)基因的鑒定與表達(dá)分析.pdf

1、作為無(wú)脊椎動(dòng)物，昆蟲(chóng)缺乏獲得性免疫，主要依賴(lài)發(fā)達(dá)的先天性免疫系統(tǒng)來(lái)抵御病原微生物的入侵。先天性免疫系統(tǒng)由細(xì)胞免疫和體液免疫兩部分組成，二者協(xié)同作用參與宿主對(duì)病原物的吞噬、集結(jié)、包囊和黑化反應(yīng)。細(xì)胞免疫是指由血細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬、節(jié)結(jié)形成和包囊等過(guò)程，體液免疫包括誘導(dǎo)抗菌肽產(chǎn)生的Toll和Imd兩條信號(hào)通路，以及多酚氧化酶原(prophenoloxidase，PPO)激活的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。柞蠶是一種重要的野生絹絲昆蟲(chóng)，屬于鱗翅目、大蠶蛾科、柞蠶屬，

2、主要分布在中國(guó)、印度和韓國(guó)。柞蠶蛹含有人體全部必需的氨基酸，作為營(yíng)養(yǎng)豐富的高質(zhì)量昆蟲(chóng)食品，除了作為紡織工業(yè)原料利用外，還有很高的藥用和食用等經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文采用抑制消減雜交的方法構(gòu)建大腸桿菌刺激的柞蠶蛹cDNA文庫(kù)，測(cè)序獲得了400條EST序列，并進(jìn)行了基因注釋和功能分類(lèi)，同時(shí)利用半定量PCR和定量PCR技術(shù)，對(duì)免疫相關(guān)基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探明柞蠶先天免疫機(jī)制以及利用生物技術(shù)提高柞蠶的抗病性提供了參考。本文的研究結(jié)果主要包

3、括以下三方面:
　　1、抑制消減雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
　　為獲得柞蠶免疫相關(guān)基因，采用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了大腸桿菌刺激后的柞蠶蛹脂肪體消減cDNA文庫(kù)，并隨機(jī)挑取400個(gè)cDNA克隆進(jìn)行了單向測(cè)序，共獲得有效EST序列328個(gè)，通過(guò)在線(xiàn)網(wǎng)站Blastn比對(duì)和通過(guò)CAP3軟件進(jìn)行序列拼接，注釋得到202個(gè)unigenes并分成九組:50個(gè)免疫應(yīng)答相關(guān)基因(25％)，三個(gè)細(xì)胞骨架相關(guān)基因(1％)，八個(gè)細(xì)胞生殖與凋亡相關(guān)基因

4、(4％)，五個(gè)能量代謝相關(guān)基因(2％)，五個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因(2％)，40個(gè)物質(zhì)代謝相關(guān)基因(20％)，10個(gè)脅迫應(yīng)答相關(guān)基因(5％)，四個(gè)轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控相關(guān)基因(2％)，77個(gè)未知蛋白(39％)。另外，通過(guò)序列拼接，得到抗菌肽-4和溶菌酶的全長(zhǎng)cDNA，氨基酸比對(duì)和進(jìn)化分析顯示它們和大蠶蛾科昆蟲(chóng)較高的同源性和較近的親緣關(guān)系。
　　2、免疫相關(guān)基因的表達(dá)分析
　　為了檢測(cè)柞蠶免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況，搜集大腸桿菌刺激柞蠶蛹不同時(shí)間

5、的脂肪體組織，通過(guò)半定量PCR和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)免疫基因表達(dá)水平。對(duì)于模式識(shí)別受體，肽聚糖識(shí)別蛋白和β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白在0.5小時(shí)大量表達(dá)，肽聚糖識(shí)別蛋白A在3小時(shí)上調(diào)超過(guò)80倍，類(lèi)免疫球蛋白也在三小時(shí)上調(diào)超過(guò)三倍，而凝集素A和球蛋白在外源物刺激前也有一定量的表達(dá)。抗菌肽蛋白是先天免疫的重要組成部分，隨機(jī)挑選的八個(gè)抗菌肽基因都能被大腸桿菌誘導(dǎo)并持續(xù)表達(dá);attacin-1在三小時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量，抗菌肽-和溶菌酶在12小時(shí)表

6、達(dá)量最大，lebocin2蛋白在24小時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)達(dá)到頂峰。此外，微卵黃原蛋白、多吧脫羧酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶theta在0.5小時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)量超過(guò)兩倍，蛋白酶抑制劑5、6、8在三小時(shí)處表達(dá)明顯增加，蛋白酶抑制劑3，絲氨酸蛋白酶1和蛋白酶抑制劑4在24小時(shí)明顯上調(diào)。
　　3、柞蠶Apolipophorin-Ⅲ基因的克隆與表達(dá)分析
　　通過(guò)RACE-PCR方法克隆獲得了柞蠶Apolipophorin-Ⅲ基因全長(zhǎng)序列:包括由40bp的5

7、'端非編碼區(qū)(5'UTR)、86個(gè)bp組成的3'端非編碼區(qū)(3'UTR)，以及由561個(gè)核苷酸組成的ORF(開(kāi)放閱讀框)編碼186個(gè)氨基酸，包含一個(gè)Apolipophorin-Ⅲ前體結(jié)構(gòu)域，分子量大小為21 kDa和等電點(diǎn)為7.96。與煙草天蛾、家蠶和埃及伊蚊的氨基酸序列一致性分別為68％、59％和23％。進(jìn)化樹(shù)分析顯示與蠶蛾科昆蟲(chóng)親緣關(guān)系較近。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Apolipophorin-Ⅲ基因在四個(gè)不同發(fā)育時(shí)期都有表達(dá)，并在

8、五齡幼蟲(chóng)部分組織表達(dá);分別注射病原物后，在不同時(shí)間點(diǎn)Apolipophorin-Ⅲ基因表達(dá)明顯上調(diào)。RT-PCR法擴(kuò)增了柞蠶Apolipophorin-Ⅲ基因部分片段，并連接至pET-28a(+)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，用IPTG進(jìn)行了不同濃度的誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blot檢測(cè)，表明被誘導(dǎo)的目的蛋白均得到了穩(wěn)定的表達(dá)并純化了重組蛋白，這為以后對(duì)柞蠶Apolipophorin-Ⅲ基因功