大鼠肺動脈高壓模型中循環(huán)血小板和白細胞的活化及血小板信號轉(zhuǎn)導通路研究.pdf

1、背景和目的：特發(fā)性肺動脈高壓(Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertention,IPAH)是一種少見的肺血管疾病,其主要特征是肺動脈壓力和肺血管阻力進行性增高,最終導致右心衰竭和死亡。IPAH基本病理學特點是肺小動脈內(nèi)皮增生和纖維化、中膜肥厚、原位血栓形成、炎癥和叢狀樣變。臨床統(tǒng)計顯示約50％的特發(fā)性肺動脈高壓患者伴發(fā)慢性肺血栓栓塞。血小板是血栓形成中最重要的細胞,循環(huán)血小板激活能夠促進肺血栓栓塞。關

2、于血小板在肺動脈高壓中的作用,并無定論。有的文獻報道在IPAH中,血栓形成的先決條件-血小板聚集反應明顯增強,血液中p-選擇素增加,均提示血小板處于活化狀態(tài)。但是,另有文獻報道,在IPAH患者中,血小板因子4和血小板球蛋白B等標志血小板活化標志物在血液中沒有增加,說明并不存在血小板活化?，F(xiàn)已證實,血小板和白細胞間存在復雜的相互作用,這種相互作用能夠增加血小板和白細胞的活化,促進炎癥和血栓形成。血小板-白細胞聚集體(platelet-le

3、ukocyte aggregations,PLAs)是這種相互作用的一種方式。該聚集體能夠促進許多疾病的發(fā)生發(fā)展,如動脈粥樣硬化、急性肺損傷等。炎癥和血栓是IPAH的主要病理改變,但是在IPAH中尚未見有關血小板、白細胞活化以及血小板-白細胞聚集體的系統(tǒng)報道。在IPAH中是否存在循環(huán)血小板和白細胞的活化以及血小板-白細胞聚集體形成增加?它們能否促進疾病的發(fā)生發(fā)展?這些是非常有趣而且值得研究的問題。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-ac

4、tivated protein kinases,MAPKs)是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究證實,MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路存在于大多數(shù)細胞內(nèi),在將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導至細胞及其核內(nèi),并引起細胞生物學反應(如細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的過程中具有至關重要的作用?，F(xiàn)已有研究證實MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的活化參與血小板的變形、粘附和聚集反應。并且在肺動脈高壓發(fā)生中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肺組織的MAPK通路活化,能夠促進平滑肌增殖,外膜成纖維細胞增生

5、等。抑制p38的活化,能夠降低肺動脈壓力,減少肺動脈肌化,抑制肺動脈高壓的進展。在肺動脈高壓中,循環(huán)血小板內(nèi)是否也存在該通路的活化?該通路的活化能否引起血小板功能改變,從而促進IPAH的進展?這些問題尚需進一步研究。因此,我們利用野百合堿(monocrotaline,MCT)誘發(fā)大鼠肺動脈高壓,應用導管法行血流動力學測定,檢測大鼠肺動脈壓力和右心室壓力,肺病理切片HE染色觀察大鼠肺血管形態(tài)學改變,以確定肺動脈高壓模型的成功建立。采用全血

6、流式細胞術,檢測肺動脈高壓時是否存在循環(huán)血小板、白細胞的活化和PLAs形成的增加,同時,應用western blotting檢測活化血小板的可能信號轉(zhuǎn)導通路。方法:1.肺動脈高壓動物模型:2%野百合堿皮下注射,誘導大鼠肺動脈高壓。對照組皮下注射1ml生理鹽水。2.HE染色病理切片:觀察大鼠肺動脈高壓模型中肺動脈和肺組織形態(tài)學改變。3.血液動力學檢測:注射野百合堿后,3周末測量右心室收縮壓(RVSP)、肺動脈平均壓(mPAP)。4.全血流

7、式細胞術測定:血小板纖維蛋白原的結合率、白細胞CD11b的表達和血小板-白細胞聚集體的形成。5.western blot法測定:血小板MAPK信號轉(zhuǎn)導通路中p38MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化。結果:1.成功建立肺動脈高壓動物模型:大鼠在注射野百合堿第三周后,出現(xiàn)進食減少、體重減輕、活動減少、呼吸急促、口唇及四肢紫紺、解剖可見大量腹水。2.肺組織病理切片可見肺動脈高壓大鼠的肺小動脈中膜較正常大鼠明顯增厚,官腔狹窄。3.血流動力學

8、測定:肺動脈高壓模型組大鼠右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈壓(mPAP)均較正常對照組明顯上升。4.全血流式細胞術檢測:在基礎狀態(tài)下,與正常對照組相比,模型組血小板纖維蛋白原的結合率顯著升高(p<0.01);加入血小板刺激劑ADP(濃度為10-6mol/L)時,模型組血小板纖維蛋白原的結合率與正常對照組相比,亦顯著升高(p<0.01)。在基礎狀態(tài)下,模型組中性粒細胞、單核細胞亞群CD11b的表達較正常對照組明顯增高(p<0.01),

9、淋巴細胞亞群CD11b的表達與正常無差異(p>0.05)。當加入白細胞刺激劑fMLP(濃度定為10-7mol/L)時,模型組中性粒細胞亞群CD11b的表達較正常對照組明顯增高(P<0.01),而單核細胞、淋巴細胞亞群CD11b的表達與正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。在基礎狀態(tài)下,模型組血小板-中性粒細胞(P-Neu)聚集體百分率較正常明顯增高(P<0.01)。加入血小板刺激劑ADP(濃度定為10-6mol/L)時,模型組P-

10、Neu聚集體形成率比正常對照組明顯增高(P<0.01),而P-Mon、P-Lym聚集體在模型組和正常對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。5.Western blot法檢測血小板MAPK信號轉(zhuǎn)導通路:在模型組大鼠的血小板內(nèi)檢測到磷酸化的p38和JNK增加。而ERK的磷酸化沒有改變。結論:1.野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓模型,3周末平均肺動脈壓和右心室收縮壓增高,肺小動脈中膜增厚,官腔狹窄,甚至閉塞。2.大鼠肺動脈高壓模型中存在循環(huán)血小